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Abstract

Phosphorylation and dephosphorylation of proteins and lipids are the major post-translational modifications involved in virtually all molecular signaling pathways in the cell and are catalyzed by kinases and phosphatases respectively. Abnormal variation in kinase and phosphatase activity leads to the development of several human diseases. Phosphatase of regenerating liver (PRL)-3 is a dual specificity phosphatase that has been related to cell proliferation, migration, invasion, and epithelial to mesenchymal transition. Interestingly, while PRL-3 is aberrantly overexpressed in primary and metastatic tumors, it is barely expressed at all in healthy human tissue. Therefore, PRL-3 represents a promising therapeutic target in cancer treatment and an emerging prognostic marker for tumor progression. However, finding robust PRL-3 substrate candidates remains a challenge in the field. The aim of the present work is to gain insight in both the cellular and molecular pathways where PRL-3 is involved. The first part of this project is focused on the characterization of the role of PRL-3 in epithelial cell polarity using organotypic 3D-culture systems. We show that overexpression of PRL-3 disrupts epithelial architecture by promoting the development of cysts with ectopic lumens that arise from mispositioned midbodies. Furthermore, we propose a novel cellular mechanism where midbodies are retained in the lateral membrane due to acceleration of cytokinesis driven by PRL-3 overexpression. The second part of the work deals with investigating PRL-3 PI(4,5)P2 phosphatase activity in cells, which was previously established in vitro. Here, we demonstrate this activity in vivo with a novel technique developed for this purpose. Moreover, we prove that the low phosphoinositide phosphatase activity of PRL-3 and its specific interaction with PI(4,5)P2 are essential for enhancing clathrin-mediated internalization. In conclusion, we show that PRL-3 overexpression disrupts epithelial cell polarization probably by accelerating cytokinesis, and we demonstrate that it is a phosphoinositide phosphatase, increasing clathrin-dependent endocytosis.

Translation of abstract (German)

Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen und Lipiden sind die häufigsten posttranslationalen Modifikationen, die in allen molekularen Signalwegen der Zelle involviert sind und durch Kinasen beziehungsweise Phosphatasen katalysiert werden. Eine Fehlfunktion der Kinase- oder Phosphataseaktivität kann zur Entwicklung verschiedenster Krankheiten führen. Die „Phosphatase of regenerating liver“ PRL-3 ist eine doppelspezifische Phosphatase, die mit Metastasierung sowie den zu Grunde liegenden Prozessen wie Zellvermehrung, Migration, Invasion und dem Übergang von Epithel- zu Mesenchymgewebe in Verbindung gebracht wird. Während PRL-3 in primären Tumoren und Metastasen überexprimiert wird, ist die Expression im gesunden menschlichen Gewebe kaum nachweisbar. Daher repräsentiert PRL-3 einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt in der Krebstherapie und dient als Marker zur Erkennung von Tumorprogression. Die Erforschung von bisher weitestgehend unbekannten PRL-3 Substraten ist jedoch noch immer im Fokus der aktuellen Forschung in diesem Bereich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, weitere Einblicke in die Funktion von PRL-3 hinsichtlich zellbiologischer sowie molekularer Signalwege zu gewinnen. Im ersten Teil des Projekts wird die Rolle von PRL-3 in der Polarität von Epithelzellen mit der Verwendung von Organ-repräsentierenden 3D Kultursystemen charakterisiert. Wir zeigen, dass eine Überexpression von PRL-3 die Epithelarchitektur der Zelle zerstört: So weisen die sich im 3D System entwickelnden Zysten, ausgehend von falsch lokalisierten Midbodies, ekotopische Lumen auf. Desweiteren demonstrieren wir einen neuen zellulären Mechanismus, bei welchem es, ausgelöst durch PRL-3 Überexpression, zu einer Beschleunigung der Zytokinese und einer daraus resultierender Ansammlung von Midbodies in der lateralen Zellmembran kommt. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Erforschung der PRL-3 PI(4,5)P2 Phosphatase Aktivität innerhalb von Zellen, die zuvor bereits in vitro gezeigt werden konnte. Mit der Verwendung einer neuen, speziell für diesen Zweck entwickelten Technik ist es uns möglich die Dephosphorylierung auch in vivo zu demonstrieren. Außerdem können wir nachweisen, dass sowohl die niedrige Phosphoinositid Phosphatase Aktivität von PRL-3 als auch die spezifische Wechselwirkung von PRL-3 mit PI(4,5)P2 essentiell für eine verbesserte Clathrin-vermittelte Endozytose sind. XVIII Zusammenfassend zeigen wir, dass die Überexpression von PRL-3 zu einer Störung der Polarität von Epithelzellen führt, vermutlich durch eine Beschleunigung der Zytokinese. Desweiteren demonstrieren wir PRL-3 als eine Phosphoinositide Phosphatase, welche die Clathrin-vermittelte Endozytose erhöht.