German Title: Ein Versuch um Chromatosom Strukturen zu entschlüsseln

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Abstract

In eukaryotic cells, DNA transcription, replication and repair events are controlled by the regulation of DNA compaction mechanisms that determine the open and closed chromatin states. Nucleosomes are the basic DNA packaging units of chromatin. The nucleosome core (NC) consists of a core histone protein octamer with approximately two tight superhelical turns of DNA wrapped around it. The NC is extended at its entry and exit points by linker DNA (L-DNA) and a linker histone (LH) protein binds between the two L-DNA arms to form a chromatosome. The dyad is the single DNA base pair between the nucleosome entry and exit points determining the symmetry axis and is used to define the position of LH binding to a nucleosome. For LH - nucleosome binding, previous studies indicate both on- and off-dyad binding modes, as well as different LH orientations. Thus, the molecular determinants of the structure of LH – nucleosome complex and the dynamics of LH – nucleosome binding are not fully understood. The aim of the research described here was to obtain an atomic-detail level understanding of chromatosome formation. Analysis of the experimentally determined structures of LH – nucleosome complexes showed that instead of a single 3D structure, an ensemble of structures of LH – nucleosome complexes exists. To understand the distribution of these ensembles, normal mode analysis (NMA), standard and accelerated molecular dynamics (MD & AMD) and Brownian dynamics (BD) simulations were applied to LH, nucleosome and chromatosome systems. MD and AMD simulations showed that the globular domain of the LH (LH GD) prefers to be in its closed form in solution. Upon nucleosome binding, the LH GD structure transformed to an open structure due to hydrophobic interactions with the L-DNA of the nucleosome. Additionally, LH GD binding constrained the flexibility of the L-DNA and affected the directions of movement of the L-DNA arms. BD simulations indicated that various chromatosome configurations were possible depending on LH GD sequence and L-DNA opening angles. These findings suggest that LH – nucleosome binding is mediated by a combination of conformational selection and induced fit mechanisms. Further BD simulations show that chromatosome configurations were affected by single point mutations in the LH GD and varied for different LH isoforms. My results indicate that by making specific single point mutation exchanges, it is possible to swap LH – nucleosome configurations among different LH GD isoforms. Similar shifts were observed in chromatosome configuration upon introduction of post translational modifications (PTMs) in the LH GD. I applied BD simulations to compute dissociation rate constant (koff) values and compare them with previously reported fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) data on the binding of various LH mutants to chromatin. The results of the BD simulations correspond with the relative trends in measured FRAP recovery half-times (t50) of LH – chromatin binding of various LH mutants. The results thus enable the interpretation of the FRAP data in terms of a physical model of LH – nucleosome binding. My thesis provides detailed insights into the structure, dynamics and kinetics of chromatosome formation in eukaryotes. The results presented in this work can guide further experiments on the sequence determinants of LH – nucleosome binding.

Translation of abstract (German)

In eukaryotischen Zellen werden DNA-Transkription, Replikation und Reparaturvorgänge durch die Regulierung der dichten Packung von DNA kontrolliert. Dies geschieht mittels Mechanismen, die die Dekondensation oder Kondensation von Chromatin beeinflussen. Die wesentlichen DNA-Verpackungseinheiten des Chromatins werden Nukleosomen genannt. Dabei besteht die Nukleosomen-Grundeinheit (‘Nukleosomen Core’, NC) aus einem Histonoktamer, um das etwa zwei flache superhelikale Windungen von DNA gewickelt sind. Erweitert wird der NC an DNA-Eintritts- sowie Austrittsstelle durch DNA-Linker (L-DNA). Mit dem zwischen den DNA-Linkern gebundenen Protein, dem Linker Histon (LH), bezeichnet man dies als Chromatosom. Das einzelne DNA-Basenpaar zwischen Eintritts- und Austrittsstelle der DNA am Nukleosom, welches die Symmetrieachse bestimmt und häufig verwendet wird, um die Position der Bindung von LH an ein Nukleosom zu beschreiben, wird ‘Dyad’ genannt. Für die Bindung von LH und Nukleosom zeigten vorherige Studien sowohl Bindung an der ‘Dyad’-Position, als auch abseits des ‘Dyad’. Ebenso wurden unterschiedliche Orientierungen des LH beobachtet, weshalb die Einflussfaktoren auf die Struktur von LH-Nukleosom Komplexen und die Dynamik der Bindung zwischen LH und Nukleosom auf molekularer Ebene nicht vollständig verstanden sind. Das Ziel der hier beschriebenen Forschungsarbeit war es, ein Verständnis der Bildung von Chromatosomen auf atomarer Ebene zu erreichen. Die Analyse experimentell ermittelter Strukturen von LH-Nukleosom Komplexen zeigte, dass statt einer einzelnen 3D-Struktur ein Ensemble von Strukturen des LH-Nukleosom Komplexes existiert. Um die Verteilung dieser strukturellen Ensembles besser zu verstehen, wurden Normalschwingungsanalysen (NMA), Standard-Molekulardynamik-Simulationen (MD), beschleunigte Molekulardynamik-Simulationen mit erweitertem Sampling (‘accelerated MD’, AMD) und Simulationen Brown’scher Moleküldynamik (BD) mit LH-, Nukleosom- und Chromatosom-Systemen durchgeführt. MD und AMD Simulationen zeigten, dass die globuläre Domäne des LH (LH GD) in Lösung eine geschlossene Form bevorzugt. Bei Bindung an das Nukleosom wird die LH GD durch hydrophobe Wechselwirkungen mit der L-DNA des Nukleosoms in eine offene Struktur überführt. Zusätzlich schränkt die Bindung der LH GD die Flexibilität und Bewegungsrichtung der L-DNA ein. BD-Simulationen wiesen auf zahlreiche mögliche Chromatosomenkonfigurationen in Abhängigkeit von der Sequenz der LH GD und den L-DNA-Öffnungswinkeln hin. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass LH-Nukleosom-Bindung durch eine Kombination von konformationeller Selektion und ‘induced fit’-Mechanismen vermittelt wird. Weitere BD-Simulationen zeigten, dass Chromatosomen-Konfigurationen durch einzelne Punktmutationen in der LH GD beeinflusst wurden und sich zwischen unterschiedlichen Isoformen des LH unterschieden. Meine Ergebnisse deuten an, dass durch Austausch spezifischer einzelner Punktmutationen zwischen verschiedenen LH GD Isoformen auch LH-Nukleosom-Konfigurationen unter diesen vertauscht werden können. Ähnliche Veränderungen der Chromatosomen-Konfiguration wurden als Ergebnis der Einführung posttranslationaler Modifikationen (PTMs) in der LH GD beobachtet. Mittels BD-Simulationen berechnete ich weiterhin die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (koff) verschiedener LH-Mutanten von Chromatin und verglich diese mit zuvor beschriebenen Daten aus FRAP-Experimenten (fluorescence recovery after photobleaching). Die Ergebnisse der BD-Simulationen zeigen dabei für LH-Chromatin-Bindung verschiedener LH-Mutanten die gleichen relativen Tendenzen wie die in FRAP-Experimenten ermittelten Diffusionszeiten, die zur Wiederherstellung von 50% der Ausgangs-Fluoreszenzintensität nötig sind (t50). Die Ergebnisse erlauben daher die Interpretation der FRAP-Daten im Sinne eines physikalischen Models von LH-Nukleosomen-Bindung. Meine Arbeit liefert detaillierte Einblicke in Struktur, Dynamik und Kinetik der Chromatosomen-Bildung in Eukaryoten. Die hier gezeigten Ergebnisse können als Orientierungshilfe für weitere Experimente zur Aufklärung des Einflusses der Sequenz auf die LH-Nukleosomen-Bindung dienen.