German Title: Analyse der Heterogenität von Tumorzellen in 3D-Zellkultursystemen durch Kombination von Bildgebungs- und Next Generation Sequencing-Technologien

PDF, English Download (27MB) | Terms of use

Abstract

Three-dimensional (3D) in vitro cell culture systems have advanced the modeling of cellular processes in health and disease by reflecting physiological characteristics and architectural features of in vivo tissues. As a result, representative patient-derived 3D culture systems are emerging as advanced pre-clinical tumor models to support individualized therapy decisions. Beside the additional progress that has been achieved in molecular and pathological analyses towards personalized treatments, a remaining problem in both primary lesions and in vitro cultures is our limited understanding of functional tumor cell heterogeneity. This phenomenon is increasingly recognized as key driver of tumor progression and treatment resistance. Recent technological advances in next generation sequencing (NGS) have enabled unbiased identification of gene expression in low-input samples and single cells (scRNA-seq), thereby providing the basis to reveal cellular subtypes and drivers of cell state transitions. However, these methods generally require dissociation of tissues into single cell suspensions, which consequently leads to the loss of multicellular context. Thus, a direct or indirect combination of gene expression profiling with in situ microscopy is necessary for single cell analyses to precisely understand the association between complex cellular phenotypes and their underlying genetic programs. In this thesis, I will present two complementing strategies based on combinations of NGS and microscopy to dissect tumor cell heterogeneity in 3D culture systems. First, I will describe the development and application of the new method ‘pheno-seq’ for integrated high-throughput imaging and transcriptomic profiling of clonal tumor spheroids derived from models of breast and colorectal cancer (CRC). By this approach, we revealed characteristic gene expression that is associated with heterogeneous invasive and proliferative behavior, identified transcriptional regulators that are missed by scRNA-seq, linked visual phenotypes and associated transcriptional signatures to inhibitor response and inferred single-cell regulatory states by deconvolution. Second, by applying scRNA-seq to 12 patient-derived CRC spheroid cultures, we identified shared expression programs that relate to intestinal lineages and revealed metabolic signatures that are linked to cancer cell differentiation. In addition, we validated and complemented sequencing results by quantitative microscopy using live-dyes and multiplexed RNA fluorescence in situ hybridization, thereby revealing metabolic compartmentalization and potential cell-cell interactions. Taken together, we believe that our approaches provide a framework for translational research to dissect heterogeneous transcriptional programs in 3D cell culture systems which will pave the way for a deeper understanding of functional tumor cell heterogeneity.

Translation of abstract (German)

Dreidimensionale (3D) in vitro Zellkultursysteme haben maßgeblich die Modellierung zellulärer Prozesse verbessert, indem physiologische Eigenschaften und strukturelle Merkmale von in vivo Geweben besser reflektiert werden. Darauf basierend entwickeln sich nun vermehrt repräsentative patientenabgeleitete 3D-Kultursysteme als verbesserte präklinische Tumormodelle, um individualisierte Therapieansätze zu unterstützen. Neben den zusätzlichen Fortschritten, die durch molekulare und pathologische Analysen hinsichtlich personalisierter Behandlungen erzielt wurden, verbleibt sowohl in primären Tumoren als auch in in vitro Zellkultur Systemen das begrenzte Verständnis der funktionellen Tumorzellheterogenität, was zunehmend als Schlüsselfaktor für Tumorprogression und Behandlungsresistenz erkannt wird. Neueste technologische Fortschritte basierend auf Next-Generation-Sequencing (NGS) ermöglichen nun Genom-weite Genexpressions-analysen in Proben mit geringem RNA-Gehalt und sogar Einzelzellen (scRNA-seq). Somit wurde die Grundlage geschaffen, sowohl zelluläre Subtypen aufzudecken als auch Gene zu identifizieren, die spezifisch Zellzustandsübergänge antreiben. Diese Ansätze erfordern jedoch im Allgemeinen die Dissoziation von Geweben in Einzelzellen, was folglich zum Informationsverlust multizellulärer Zusammenhänge führt. Daher wird grundsätzlich eine direkte oder indirekte Kombination von RNA-Sequenzierung und Mikroskopie für Einzelzellanalysen benötigt, um die Assoziation zwischen komplexen zellulären Phänotypen und ihren zugrunde liegenden genetischen Programmen genau zu verstehen. In dieser Arbeit präsentiere ich zwei komplementäre Strategien basierend auf der Kombination von Mikroskopie und NGS, um die Heterogenität von Tumorzellen in 3D-Zellkultursystemen zu analysieren. Zunächst werde ich die Entwicklung und Anwendung der neuen Methode "pheno-seq" beschreiben, in welcher Hochdurchsatz-Bildgebung und RNA-Sequenzierung klonaler Tumor-Sphäroide direkt kombiniert wird. Durch diesen Ansatz konnten wir charakteristische Genexpressionssignaturen in 3D-Modellen von Brust- und Dickdarmkrebs nachweisen, die mit heterogenem invasivem und proliferativem Verhalten assoziiert sind. Zudem konnten wir Transkriptionsregulatoren identifizierten, die mit Hilfe von scRNA-Seq nicht identifiziert werden konnten, aus visuellen Phänotypen und assoziierten Genexpressionssignaturen Inhibitorantworten vorhersagen und regulatorische Einzelzellzustände errechnen. Zweitens haben wir durch Anwendung von scRNA-seq auf 12 Patienten-abgeleitete Kolorektalkrebs-Sphäroidkulturen gemeinsame Expressions-programme identifiziert, die sich auf intestinale Subtypen beziehen und konnten metabolische Signaturen aufzeigen, die mit der Krebszelldifferenzierung in Verbindung stehen. Darüber hinaus haben wir Sequenzierungsergebnisse durch quantitative Mikroskopie unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und multiplexed RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) validiert und ergänzt, wodurch eine metabolische Kompartimentierung und mögliche Zell-Zell-Wechselwirkungen aufgedeckt werden konnte. Wir sind davon überzeugt, dass unser Rahmenkonzept zur Analyse der zellulären Heterogenität in 3D-Zellkultursystemen mithilfe von Kombinationen aus NGS und Mikroskopie von hohem Wert für die translationale Forschung ist und den Weg für ein detaillierteres Verständnis der intratumoralen Heterogenität ebnen wird.