English Title: Investigations on the biology of infection and the heritability of infection parameters from entomopathogenic nematodes for larvae of the cockchafer (Melolontha spp.) and on the characterisation of the nematodes by DNA fingerprinting

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Abstract

Entomopathogene Nematoden (Fadenwürmer) der Gattungen Heterorhabditis und Steinernema werden zur biologischen Bekämpfung von im Boden lebenden Schadinsekten eingesetzt. Die infektiösen Larven dieser Nematoden (Dauerlarven) beherbergen in ihrem Darm symbiotische Bakterien, die für die pathogene Wirkung verantwortlich sind. Die vorliegende Arbeit untersucht die Infektionsbiologie und Wirkbedingungen dieser Nematoden bei Larven (Engerlingen) des Feld- und Waldmaikäfers (Melolontha melolontha und M. hippocastani) sowie des Junikäfers (Amphimallon solstitialis). Es wurden verschiedene Nematodenarten und -stämme getestet und bei zwei Arten wurde geprüft, ob deren Wirksamkeit durch Selektion gesteigert werden kann. Die aus den USA stammende Art S. glaseri und ein neu in Marokko isolierter Steinernema-Stamm hatten mit 60-85% bei 1000 applizierten Dauerlarven pro Engerling die größte Wirksamkeit. Die Heterorhabditis-Stämme erreichten nur 5-25%. Eine Vorinfektion der Engerlinge mit Rickettsien erhöhte jedoch die Wirksamkeit um den Faktor 3-6. In lehmigem Bodensubstrat war die Wirksamkeit beider Nematodenarten deutlich geringer als in sandigem. Das L2-Stadium der Engerlinge war deutlich anfälliger als das L3-Stadium. Die Infektiosität von H. bacteriophora (kommerzieller Hybrid-Stamm, E-Nema) gegenüber Larven des Feldmaikäfers ließ sich durch Selektion über Wirtspasssagen nicht steigern, die ermittelte realisierte Heritabilität war nahezu null. Im Gegensatz hierzu konnte bei S. glaseri (North Carolina) die Infektiosität durch 10 Wirtspassagen um den Faktor 9-15 gesteigert werden, die ermittelte realisierte Heritabilität war etwa 0,7. Auffällig war, dass die Länge der Dauerlarven von S. glaseri während der Selektion um etwa 20% zunahm und der Fettgehalt dieser Dauerlarven signifikant erhöht war. Die Selektionswirkungen lassen sich durch die unterschiedlichen Befallsstrategien deuten. H. bacteriophora hat größere Schwierigkeiten, in einen Engerling einzudringen. Es penetrieren nur wenige Dauerlarven, aber bereits 1-3 im Hämocoel genügen, um den Engerling durch die hoch virulenten symbiotischen Bakterien zu töten („Einzelkampfstrategie“). Die geringe Überlebensrate primär penetrierter Dauerlarven und weitere exo- und endogene Faktoren wurden als Ursache für die schwankende Wirksamkeit und das Ausbleiben einer positiven Selektionswirkung diskutiert. Bei S. glaseri penetriert eine größere Zahl von Dauerlarven und die Überlebensrate primär penetrierter Dauerlarven ist höher. Durch die geringe Virulenz der symbiotischen Bakterien ist eine Mindestzahl von etwa 15-50 penetrierten Dauerlarven nötig, um den Engerling zu töten („Gruppenstrategie“). Zur Überprüfung, ob sich die Selektionslinien und Re-Isolate von Freilandapplikationen anhand von molekularen Markern von den Ausgangsstämmen unterscheiden lassen, wurden die Methoden der RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA - polymerase chain reaction) und der ISSR-PCR (inter simple sequence repeats) angewandt. Die mittels der RAPD- bzw. der ISSR-PCR-Analyse ermittelte durchschnittliche genetische Distanz zwischen den Arten H. bacteriophora, H. marelatus, H. megidis, S. arenaria, S. feltiae, S. glaseri und C. elegans betrug 76 bzw. 80%. Die Distanzen waren für beide Methoden ähnlich, die Reproduzierbarkeit bei der ISSR-PCR-Methode jedoch deutlich besser. Innerhalb der Arten waren die Distanzen bei der ISSR-PCR-Analyse für H. bacteriophora (13 Stämme) etwa 48%, bei H. megidis (4 Stämme) etwa 11% und bei S. glaseri (3 Stämme) 31%. Bei den im Kaiserstuhl (Süddeutschland) aus Larven des Feldmaikäfers isolierten Nematoden handelte es sich um zwei deutlich unterscheidbare Stämme bzw. Genotypen der Art H. bacteriophora. Bei dem Steinernema-Stamm aus Marokko scheint es sich um eine eigene Art zu handeln, die mit S. arenaria und S. feltiae näher verwandt ist als mit S. glaseri. Die 20 Inzuchtlinien des H. bacteriophora-Hybridstammes PS7 hatten eine durchschnittliche Distanz von 19%. Ein Zusammenhang zwischen der Distanz einzelner Inzuchtlinien und deren Infektiosität bzw. Penetrationsaktivität bei Larven des Mehlkäfers (Tenebrio molitor) war nicht zu erkennen. Die Distanz zwischen dem Ausgangsstamm der Selektion und der Selektionslinie betrug bei H. bacteriophora 23% und bei S. glaseri 26%. Genetische Veränderungen während der Selektion waren also nachweisbar. Die Distanz zwischen dem applizierten, kommerziell produzierten Ausgangsstamm von H. bacteriophora (E-Nema, Raisdorf, Deutschland) und drei seiner von verschiedenen Standorten re-isolierten Linien betrug 35%. Diese größeren Distanzen bei den Re-Isolaten weisen auf einen höheren Selektionsdruck unter Freilandbedingungen hin. Die ISSR-PCR-Methode ist demnach dazu geeignet, geografische Stämme entomopathogener Nematoden als auch Inzuchtlinien, Selektionslinien bzw. Re-Isolate innerhalb eines Stammes zu unterscheiden. Bei den sequenzierten ISSR-PCR-Produkten waren keine codierenden DNA-Abschnitte nachweisbar.

Translation of abstract (English)

Entomopathogenic nematodes of the genera Heterorhabditis and Steinernema are commonly used in biological control of soil-dwelling pest insects. The infective juveniles (dauerlarvae) of these nematodes carry insect pathogenic symbiotic bacteria in their alimentary tract. The work presented here investigates the biology of infection and the work conditions of these nematodes for larvae (white grubs) of the cockchafer (Melolontha melolontha and M. hippocastani) and the June Beetle (Amphimallon solstitialis). Various nematode species and strains were tested and for two species the possibility of selection-based improvement of their efficiency was investigated. The species S. glaseri (USA) and a new Steinernema-isolate from Morocco exhibited the highest efficiency (60-85%) after application of 1.000 dauerlarvae per white grub. Heterorhabditis species and strains achieved only 5-25%. A pre-infection of the white grubs with rickettsia increased the efficiency about a factor of 3-6. The efficiency of both nematode species was higher in loamy soil than in sandy soil. The L2-stage of the white grubs was more susceptible than the L3-stage. The infectivity of H. bacteriophora for larvae of the European Cockchafer could not be increased through selection via host passages, the assessed realised heritability was nearly zero. In contrast, the infectivity of S. glaseri could be increased through 10 host passages about the factor 9-15, the ascertained realised heritability was about 0.7. During selection the length of the dauerlarvae of S. glaseri increased by about 20%. The lipid content of these dauerlarvae was significantly increased. The selection responses are explainable in terms of different invasion strategies. H. bacteriophora enters a white grub less effectively. Only few dauerlarvae penetrate, but already 1-3 in the hemocoel are sufficient to kill the white grub through the highly virulent symbiotic bacteria (“single fight strategy”). Proposed causes for the absence of positive selection responses and the high fluctuations of the efficiency are the low survival rate of primary penetrated dauerlarvae and further exo- and endogenous factors. In S. glaseri a higher number of dauerlarvae penetrates and the survival rate of those primarily penetrated dauerlarvae is higher. The virulence of the symbiotic bacteria is low, so that at least 15-50 dauerlarvae must invade in order to kill the white grub (“group strategy”). To examine if the selected lines and re-isolated field released strains can be distinguished from their origin strains via molecular markers the methods of RAPD-PCR (random amplified polymorphic DNA – polymerase chain reaction) and ISSR-PCR (inter simple sequence repeats) were applied. The average of the ascertained genetic distances between the species H. bacteriophora, H. marelatus, H. megidis, S. arenaria, S. feltiae, S. glaseri and C. elegans was 76% and 80%, respectively. Both methods yielded similar distances but reproducibility was clearly better for the ISSR-PCR. Based on ISSR-PCR the mean genetic distances within species were 48% for H. bacteriophora (13 strains), 11% for H. megidis (4 strains) and 31% for S. glaseri (3 strains). The nematodes that had been isolated from white grubs of the European Cockchafer in the area of the Kaiserstuhl (southern part of Germany) could be classified as two clearly distinguishable “genotypes” (strains) of H. bacteriophora. The Steinernema isolate from Morocco seems to be a new species, which is closer related to S. arenaria and S. feltiae than to S. glaseri. The mean genetic distance between the 20 inbred lines from the H. bacteriophora hybrid “PS7” was 19%. The genetic distance between single inbred lines was not correlated with infectivity or penetration activity of the nematodes into larvae of the Meal Beetle (Tenebrio molitor). The distance between the original strain of the selection and the selected lines for H. bacteriophora and S. glaseri was 23% and 26%, respectively. This testified to changes in the genotype during selection. The distance between the original field-released commercially produced hybrid of H. bacteriophora (E-Nema, Raisdorf, Germany) and three of its re-isolated lines from different localities was 35%. These higher distances of the re-isolates points to a higher selection pressure under field conditions. The ISSR-PCR-method allows to discriminate geographic strains of entomopathogenic nematodes and even inbred-lines, selection-lines and re-isolates within a strain. None of the sequenced ISSR-PCR products represented coding DNA regions.