German Title: Eine neuartige Funktion für den eukaryontischen Translations-Elongationsfaktor 1A

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Abstract

The eukaryotic translation elongation factor 1A, eEF1A, a homolog of the bacterial EF1A (formerly known as EF-Tu), is a well-characterized ribosome associated factor, responsible for the delivery of aminoacyl-tRNAaa to the ribosomal A site. In contrast to this indirect interaction with the nascent polypeptide chain it is shown here for the first time that eEF1A also associates directly with the nascent polypetide chain distal to the peptidyl transferase center of the ribosome. This is demonstrated for a variety of nascent polypeptide chains of different length and sequence. Interestingly, unlike other ribosome associated factors, eEF1A also interacts with polypeptides after their release from the ribosome. It is further demonstrated that eEF1A does not bind to correctly folded full-length proteins, but interacts specifically with proteins that are unable to fold correctly in a cytosolic environment. This association was demonstrated both by photo-crosslinking and by a functional refolding assay. Furthermore, it is shown that the interaction of the nascent polypeptide chain with eEF1A can be competed out with a variety of short peptides. However, the found minimum length of 20-30 amino acids for these short peptides is significantly longer than typical binding sites in molecular chaperones or MHCs which is about seven to nine amino acids in length. The presence of charged aa-tRNAaa or uncharged tRNAaa in crosslinking experiments elicited a dose-dependent response similar to that seen in the competition experiments with short peptides. Gel-filtration demonstrated that eEF1A exhibits �quasi chaperone� activities, because eEF1A seems to be able to dissolve large complexes of oligomerized peptides and co-migrates with the dissolved peptide. Based upon the results of this work a model describing a novel function for eEF1A is presented.

Translation of abstract (German)

Der eukaryontische Translations-Elongationsfaktor 1A (eEF1A) ist ein sehr gut charakterisierter Ribosom-assoziierter Faktor, der für die Lieferung von Aminoacyl-tRNAaa zur ribosomalen A Stelle verantwortlich ist. Er ist homolog zum bakteriellen EF1A (früher EF-Tu genannt). Der Elongationsfaktor 1A ist nicht nur für die indirekte Interaktion über die aa-tRNAaa mit der naszierenden Polypeptidekette verantwortlich, sondern er tritt, wie hier zum ersten Mal gezeigt wird, auch direkt mit der naszierenden Polypeptidekette distal des Peptidyltransferasezentrums des Ribosoms in Kontakt. Dies wird mit einer Vielzahl von naszierenden Polypeptidketten von verschiedener Länge und Sequenz demonstriert. Interessanterweise interagiert eEF1A im Gegensatz zu anderen Ribosom-assoziierten Faktoren auch mit Polypeptidketten, nachdem diese vom Ribosom losgelöst sind. Weiterhin wird gezeigt, daß eEF1A präferentiell an nicht korrekt gefaltete Proteine bindet, wenn diese sich nach erreichen der vollen Länge vom Ribosom lösen. Dieser enge Kontakt wurde sowohl mittels Photoquervernetzung als auch durch funktionale Rückfaltungsexperimente demonstriert. Es wird zudem gezeigt, daß die Interaktion der naszierenden Polypeptidekette mit eEF1A durch verschiedene kurze Peptide kompetitiert werden kann. Im Verlaufe der Arbeit wurde klar, daß eine Minimumlänge von 20-30 Aminosäuren für die Verdrängung benötigt wird. Dies ist jedoch signifikant länger als die sieben bis neun Aminosäuren von Peptiden, die typischerweise an molekulare Chaperone oder MHCs binden. Ein ähnlicher Verdrängungseffekt wurde mit geladener aa-tRNAaa und ungeladener tRNAaa in Quervernetzungsexperimenten in Dosisabhängigkeit hervorgerufen. Mit Gelfiltration wurde nachgewiesen, daß eEF1A in der Lage ist, große Komplexe aus oligomerisierten Peptiden aufzulösen. In diesem Verhalten ähnelt eEF1A einem molekularem Chaperone. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit wird ein Modell vorgestellt, daß eine neuartige Funktion für eEF1A beschreibt.