German Title: Mechanistische Studien über die Aktivierung der Transkription mittels DNA Schleifenbildung in einem prokaryotische Promotor-Enhancer System

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Abstract

In this thesis, transcription activation was studied in a prokaryotic promoter-enhancer system. It comprises the E. coli RNA polymerase, which is associated with the alternative sigma factor sigma54 (RNAP-sigma54), and the transcription activator protein NtrC (nitrogen regulatory protein C), which binds to a remote enhancer region to the promoter. Enhancer-bound NtrC contacts the RNA polymerase at the promoter by means of DNA looping (closed complex) and induces DNA melting of the promoter DNA by RNAP-sigma54 (open complex). The following aspects of this process were studied: (1) Three different sigma54-specific promoter sequences were analyzed in binding studies and in in vitro transcription experiments. These promoters were known to have different overall promoter strength as determined by in vivo expression and DNA footprinting studies. Since initiation of transcription comprises different subsequent steps (promoter-binding by RNAP-sigma54, isomerization to the open complex and formation of a stable elongation complex) it was still unclear, which is the rate limiting step of the total reaction. For the glnAp2 and nifL promoters, the promoter-binding by RNAP-sigma54 was rate limiting. In contrast, for the nifH promoter with a high affinity to RNAP-sigma54 but with a low in vivo expression level, the DNA melting step determined the overall speed of the transcription initiation reaction. (2) By scanning force microscopy it was determined that promoter-bound RNAP-sigma54 bends the DNA and is for this reason preferably localized in the end-loop of a supercoiled DNA, since the DNA is more bent in this region. The localization in the end-loop facilitates the interaction between NtrC and RNAP-sigma54 in spite of the low flexibility of the intervening DNA. (3) The interaction between sigma54 and NtrC was studied in an ATPase assay and in gel shift experiments. It was shown that sigma54 has no effect on the ATPase activity of NtrC under the experimental conditions whereas enhancer-binding of NtrC strongly stimulates the ATPase activity by facilitating the oligomerization of NtrC. Binding studies that were performed by analytical ultracentrifugation and gel shift experiments have also shown that sigma54 alone only weakly bind sthe promoter DNA in contrast to the RNAP-sigma54 holoenzyme. This supports the idea, that the sigma factor acts by recognizing the promoter sequence whereas the RNAP holoenzyme provides the binding energy for high affinity promoter binding. (4) In vitro transcription experiments showed that NtrC activates with different efficiency and can even act as a repressor depending on the position, number and arrangement of its binding sites. Certain combinations of weak and strong NtrC binding sites were shown to activate transcription from the promoter at very different concentrations of NtrC. This enables a regulation of transcription in dependence of the NtrC concentration. From these results, a model of RNAP-sigma54-NtrC-mediated transcription activation was developed: Accordingly, the proximal NtrC sites very close to the promoter facilitate the interaction between activator and RNA polymerase in a loop complex at low NtrC concentrations, whereas at higher concentrations the transcriptional activation is limited to a maximum level. In this case, a NtrC species is formed, which can interact with the RNAP-sigma54 without DNA looping.

Translation of abstract (German)

In dieser Arbeit wurde die Aktivierung der Transkription in einem prokaryotischen Promotor-Enhancer-System untersucht. Es besteht aus der E. coli RNA-Polymerase, die mit der alternativen Sigma-Untereinheit sigma54 assoziiert ist (RNAP-sigma54) und dem Transkriptions-Aktivatorprotein NtrC (Nitrogen regulatory protein C), das vom Promotor entfernt an die Enhancer-Region bindet. NtrC am Enhancer kontaktiert unter Schleifenbildung der DNA die RNA-Polymerase am Promotor (geschlossener Komplex) und induziert das Aufschmelzen der Promotor-DNA durch RNAP-sigma54 (offener Komplex). Folgende Aspekte dieser Reaktion wurden untersucht: (1) In Bindungsstudien und in in vitro Transkriptionsexperimenten wurden drei verschiedene sigma54-spezifischen Promotorsequenzen analysiert. Diese Promotoren waren, wie aus in vivo Expressionsstudien und DNA Schutzexperimenten bekannt, von unterschiedlicher Promotorstärke. Da die Initiation der Transkription aus verschiedenen nacheinander ablaufenden Schritten besteht (Promotorbindung der RNAP, Isomerisierung zum offenen Komplex und Bildung eines stabilen Elongationskomplexes) war bis dahin unklar, welches der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion ist. Für die Promotoren glnAp2 und nifL war die Promotorbindung der RNAP-sigma54 geschwindigkeitsbestimmend. Im Gegensatz dazu war für den nifH Promotor, der zwar eine starke Affinität zu RNAP-sigma54 besitzt, aber nur schwach in vivo exprimiert, das Aufschmelzen der DNA bestimmend für die Gesamtreaktion der Transkription. (2) Mittels Rasterkraftmikroskopie wurde festgestellt, dass die gebundene RNAP-sigma54 die DNA krümmt und deshalb vorzugsweise in der Endschleife einer superhelikalen DNA lokalisiert wird, da dort die DNA stärker gebogen ist. Diese Lokalisation in der Endschleife erleichtert die Interaktion zwischen NtrC and RNAP-sigma54 trotz der geringen Biegsamkeit der dazwischen liegenden DNA. (3) Die Interaktion zwischen sigma54 und NtrC wurde in einem ATPase-Test und in Gelshift-Experimenten analysiert. Es wurde festgestellt, dass sigma54 die ATPase-Aktivität von NtrC unter den Versuchsbedingungen nicht beeinflusst, während die Bindung von NtrC an den Enhancer die Aktivität durch Oligomerisierung von NtrC stark stimuliert. Bindungsstudien, die mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifugation und Gelshift-Experimenten durchgeführt wurden, haben außerdem gezeigt, dass sigma54 allein den Promotor nur sehr schwach binden kann im Gegensatz zum RNAP-sigma54-Holoenzym. Dies unterstützt die Vorstellung, dass die Sigma-Untereinheit vor allem dazu dient, die Promotorsequenz zu erkennen, während das RNAP-Holoenzym die Bindungsenergie für eine hochaffine Promotorbindung liefert. (4) In in vitro Transkriptionsexperimenten wurde gezeigt, dass NtrC je nach Position, Anzahl und Zusammenstellung seiner Bindungsstellen die Transkription verschieden stark aktiviert oder sogar als Repressor wirken kann. Es zeigte sich, dass der Promotor mit bestimmten Kombinationen aus starken und schwachen NtrC-Bindungsstellen bei sehr unterschiedlichen NtrC-Konzentrationen aktiviert wird. Dies ermöglicht die Regulation der Transkription in Abhängigkeit von der NtrC-Konzentration. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Transkriptionaktivierung auch ohne DNA-Schleifenbildung bei höheren NtrC-Konzentrationen stattfindet. Anhand dieser Ergebnisse wurde ein Modell der RNAP-sigma54-NtrC-vermittelten Transkriptionsaktivierung erstellt: Demnach erleichtern NtrC-Bindungsstellen nahe des Promotors die Interaktion zwischen NtrC und RNA-Polymerase im Loopkomplex bei niedrigen NtrC-Konzentrationen, während sie bei höheren Konzentrationen die Transkriptionsaktivierung auf ein bestimmtes Maximum limitieren. In diesem Fall wird eine andere NtrC-Spezies gebildet, die ohne DNA-Schleifenbildung mit der RNAP-sigma54 interagieren kann.