English Title: Function of the muscle-specific kinase MuSK : analysis in a transgenic animal

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Abstract

In der Entwicklung der neuromuskulären Synapse (NMJ) spielt die muskelspezifische Kinase (MuSK) eine zentrale Rolle. Die Expression der Acetylcholinrezeptoren (AChR) ist in den Muskelfasern während der Embryonalphase von MuSK abhängig, so dass MuSK-defiziente Tiere keine NMJ entwickelt haben und bei der Geburt sterben. Diese Ergebnisse erlauben jedoch keine Aussage darüber, welchen Einfluss MuSK auf die etablierte NMJ besitzt. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Mauslinie (MuSK/Cre) etabliert und analysiert, in der mit Hilfe des Cre-loxP-Systems eine postnatale Inaktivierung von MuSK erreicht wird. Diese Tiere sind bei Geburt lebensfähig und besitzen normal etablierte NMJ. Ab der dritten Woche entwickeln sie jedoch eine progressive Muskelschwäche, die vor Erreichen des 30. Lebenstags (P30) zum Tode führt. Histologische Untersuchungen zeigen, dass es in diesen Tieren zu einem Auflösen der etablierten NMJ kommt, da die Inaktivierung von MuSK zu einem Verlust von AChR und zum Verschwinden der subsynaptischen Kerne führt. Darüber hinaus zeigen die innervierenden Motoneurone ein extensives Wachstum und verstärktes Verzweigen, sowie atypische Innervierungen der Synapsen. Eine daraus resultierende gestörte Transmission konnte durch elektrophysiologische Analysen belegt werden. Als Reaktion auf diese gestörte Verbindung zwischen Neuron und Muskel ändert sich in den MuSK/Cre-Tieren die Faserzusammensetzung der Muskeln. Neben dem Auflösen der etablierten NMJ kann in den MuSK/Cre-Tieren auch eine Neubildung von NMJ beobachtet werden. Da es in der Entwicklung der NMJ zu einem Untereinheitenaustausch in den AChR kommt, wurde die Expressionen der fötalen γ- als auch der adulten εAChR-Untereinheit und von MuSK gemessen. Die Expression der γAChR-Untereinheit ist ebenso wie die Expression von MuSK signifikant verstärkt, während die Expression der εAChR leicht reduziert ist. Durch die Generierung und Analyse der Mauslinie MuSK/Cre:γGFP konnte eine Synthese der γAChR-Untereinheit festgestellt werden, doch war es histologisch und elektrophysiologisch nicht möglich deren Einbau in die NMJ nachzuweisen. Neben der Generation der MuSK/Cre-Tiere wurde in der vorliegenden Arbeit auch eine Methode etabliert, in Muskelfasern einen Knock-Down von synapsenspezifischen Proteinen mit Hilfe der Einzelfaserinjektion von siRNA-codierenden Plasmiden zu erreichen. So konnte eine Beteiligung von Dvl und PAK an der Erhaltung der Struktur der NMJ bewiesen werden. Zusammengefasst konnte mit den MuSK/Cre-Tieren die essentielle Funktion von MuSK für der Struktur- und Funktionserhaltung der NMJ nachgewiesen werden. Da es in diesen Tieren zu einem gleichzeitigem Auflösen und Neuetablierung von NMJ kommt, können diese Tiere in Zukunft auch weitere Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen dieser Prozesse geben. Auch könnte das extensive Wachstum der Motoneurone eine genauere Analyse der dazu notwendigen Faktoren und Bedingungen erlauben. Darüber hinaus ist es möglich, die MuSK/Cre-Maus als ein Modell für einige myasthenische Syndrome zu verwenden, da gefundene Fälle von Myasthenie in Menschen auf eine Reduktion von MuSK durch Autoimmun-Antikörper beruhen. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit einer Einzelfaserinjektion von siRNA-codierenden Plasmiden die Untersuchung synapsenspezifischer Proteinen gezielt untersucht werden können.

Translation of abstract (English)

The muscle specific kinase (MuSK) plays a crucial role in development of the neuromuscular junction (NMJ). The expression of the nicotinic acetylcholine receptors (AChR) in the embryonic muscle fibers depends on the activity of MuSK. Thus MuSK-deficient mice die directly after birth because of the lack of established NMJ. Nevertheless, the role of MuSK in an adult NMJ still remains unclear. To resolve this questions in this work a mouse line (Musk/Cre) was established and analyzed, where MuSK was conditionally inactivated by use of the Cre-loxP system. These mice are healthy and viable at birth and show normally developed NMJ. But from the third week on they develop severe muscle weakness leading to death before postnatal day 30. Their NMJ revealed structural changes and finally disappear which could be observed by histological analysis. In addition the motoneurons show extensive growth and sprouting and atypical innervations of the synapses. Multiple innervated synapses were detected with immunohistochemistry and electrophysiological methods. Probably, as a consequence of alterations in neuronal stimulation the muscles changed their fiber type composition. With the loss of established NMJ formation of new synapses can be observed in MuSK/Cre mice. In this respect it was of interest to analyze the subunit composition of the AChR with regard to the expression of the fetal γ-and adult εAChR subunits. The results show that the expression of γAChR subunit and MuSK is significant increased, while the expression of the εAChR subunit is slightly reduced. By generating and analyzing the mouse line MuSK/Cre:γGFP the synthesis of the γAChR subunit could be verified, but its incorporation in the NMJ was not detectable by histological and electrophysiological analysis. In addition a method was established, where in single muscle fibres a knock down of synapse specific proteins can be achieved by injection of plasmids encoding for specific siRNA. With this method the contribution of the Dvl and PAK in the MuSK-signalling pathway to the maintenance of postsynaptic structure of the NMJ was confirmed. In summary the results show, that MuSK is not only necessary for development, but is also essential for maintenance and proper function of established NMJ. Because of simultaneously disappearances and new forming of NMJ in muscles of the MuSK/Cre mice, it would be possible to use these mice to obtain more deep insights into molecular and cellular mechanism of these processes. Also the extensive growth of motoneurons could be used to examine the required factors and their influence. This mouse line can furthermore serve as a model organism for specific mysthenic syndromes, because some human patients exhibit MuSK specific autoimmune antibodies resulting in muscle weakness. Additionally in this work it could be shown, that injection of siRNA encoding plasmids can be used as a tool to analyze the function synapse specific proteins.