English Title: Biochemical Analysis of SNARE Protein Interactions – Role of Transmembrane Domain

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Abstract

SNARE (soluble NSF attachment protein receptor) Proteine umfassen verschiedene Familien von Proteinen, welche in Eukaryonten von der Hefe bis hin zum Menschen vorkommen. Sie sind für die Membranfusion bei zellulären Prozessen, wie Vesikeltransport, Neurotransmitterausschüttung oder Hefevakuolenfusion, unerlässlich. Vor der Membranfusion assemblieren SNARE zu einem stabilen Komplex. Dies beginnt nach dem „zipper“ Modell am zytoplasmatischen Bereich und setzt sich dann zu der Transmembrandomäne (TMD) fort. Bisher deuten Ergebnisse darauf hin, dass die TMD von SNARE Proteinen nicht nur deren Verankerung in der Membran übernimmt, sondern auch für die Funktion wichtig ist. In dieser Arbeit habe ich die Rolle der TMD bei der Assemblierung des neuronalen SNARE Proteins Synaptobrevin II und der SNAREs aus Hefevakuolen erforscht. Andere Arbeitsgruppen zeigten, dass die Homodimerisierung des bei der Neurotransmitterausschüttung beteiligten Synaptobrevin II von dessen TMD abhängt. Hier wurde gezeigt, dass diese Assemblierung in Anwesenheit von Harnstoff besser erfolgt, als ohne ihn. Dabei wurde durch CD-Messungen nachgewiesen, dass Harnstoff die -helikale Struktur der TMD nicht beeinflusst. Die Charakterisierung der TMD bei der Assemblierung von SNARE Proteinen während der Hefevakuolenfusion erfolgte unter nativen Bedingungen. Mit Saccharosegradienten wurde gezeigt, dass das vakuoläre SNARE Vam3p Homodimere ausbildet und dies deutlich von der TMD abhängt, während dies bei Selbstinteraktionen von Nyv1p und Vti1p nicht der Fall ist. Die SNARE Proteine Vam7p und Ykt6p, ohne TMD, lagen überwiegend als Monomere vor. Die in vitro Assemblierung der vakuolären SNARE Proteine Vam3p, Nyv1p, Vam7p und Vti1p, wurde durch Saccharosegradient mit anschließender co-Immunopräzipitation untersucht. Der Komplex wurde spezifisch durch Sec18p und Sec17p in Anwesenheit von ATP getrennt, wie dies in Hefe der Fall ist, und somit dessen biologische Relevanz verdeutlicht. Die Ausbildung des Komplexes wird auch durch die TMD von Vam3p beeinflusst, da teilweise bei deren Nichtvorhandensein unspezifische Multimere entstehen. Bei der Untersuchung der Bildung des zytoplasmatischen SNARE-Komplexes an Proteinen ohne TMD wurden im Vergleich zu den Proteinen von voller Länge Multimere von höherer molekularer Masse nachgewiesen. Ein pentamerer SNARE Komplex mit Ykt6p konnte unter diesen experimentellen Bedingungen nicht nachgewiesen werden.

Translation of abstract (English)

SNARE (soluble NSF attachment protein receptor) proteins comprise distinct families of proteins conserved from yeast to human, which are essential for membrane fusion in cellular processes like vesicle trafficking, neurotransmitter release or yeast vacuole fusion. Prior to membrane fusion, SNARE assemble to form a stable complex, that according to the “zipper” model starts from the cytosolic domain and is propagated to the transmembrane domain (TMD). Previous evidence indicated that the TMD of SNARE proteins has not only the role of anchoring the protein to the membrane but is important for the function. In this work, I investigated the role of TMD in assembly of the neuronal SNARE synaptobrevin II and of the yeast vacuolar SNAREs. Homodimerization of the neuronal SNARE synaptobrevin II, involved in the neurotransmitter release, previously was shown by different authors to depend on its TMD. Here synaptobrevin II Homodimerization was shown to be preserved better in the presence of urea than in its absence. At the same time, urea is not affecting α-helical structure of its TMD as detected by CD measurement. The role of TMD in yeast vacuolar SNARE protein assembly is here characterized under native conditions. Sucrose gradients showed that the vacuolar SNARE Vam3p forms a homodimer that is clearly dependent on its TMD, while Nyv1p and Vti1p self-interactions are not dependent on their TMD. The other vacuolar SNARE proteins Vam7p and Ykt6p, lacking a TMD, are detected mainly as monomers. In vitro assembly of vacuolar full length SNARE complex composed by Vam3p, Nyv1p, Vam7p and Vti1p was studied by sucrose gradient coupled to co-immunoprecipitation. The in vitro assembled complex was specifically disassembled by Sec18p and Sec17p in presence of ATP, like native SNARE complexes, demonstrating its biological relevance. Moreover, SNARE complex assembly is modulated by the Vam3p TMD as its deletion leads to partial formation of unspecific multimers. In vitro assembly of cytosolic SNARE complex, in which TMD has been deleted from all proteins, is also studied. In comparison with the full length SNARE complex, high molecular weight multimers were detected here. A pentameric SNARE complex with Ykt6p could not be identified in the present experimental condition.