German Title: Proteinen- und RNS Sequenzen, die die Genexpression in Trypanosoma brucei regulieren

Preview

PDF, English Download (4MB) | Terms of use

Abstract

Trypanosoma brucei, der afrikanische Trypanosomiasis oder Schlafkrankheit verursacht, ist einer der bisher am besten untersuchten biologischen Modellorganismen. Um sich an unterschiedliche Umgebungen anzupassen, reguliert dieser Parasit die Genexpression posttranskriptionell, hauptsächlich über mRNS Stabilität und Translation. Diese Prozesse werden durch die Interaktion zwischen Sequenzen, die sich in der 3'-UTR befinden und Proteinen reguliert. Trotz ihrer Rolle in vielen Aspekten des RNS-Metabolismus ist die Funktion der meisten RRM-Proteine unbekannt. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von RBP3 und seiner Rolle in der post-transkriptionellen Kontrolle. Orthologue dieses Proteins findet man in T. cruzi, T. congolense und L. major. Überexpression und Hemmung von TbRBP3 mittels RNAi zeigen eine stadium-spezifische Rolle für dieses Protein in den Blutstromzellen an. Microarraystudien, die Wildtypzellen mit TbRBP3-RNAi oder –überexprimierenden Zellen vergleichen, führten nicht zur Identifikation einer Ziel-mRNS. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass dieses Protein keine Funktion bei der Kontrolle von mRNS Mengen hat. Isolation der TbRBP3-RNP Komplexe erlaubte die Identifizierung von verschiedenen mRNS, die selektiv dieses Protein binden. Insbesondere wurden die Interaktion der cyclin F-Box und ZFP-mRNS durch RT-PCR bestätigt und die Rolle der Überexpression von TbRBP3 auf mRNA Levels wurde durch Northernblotanalyse untersucht. Versuche, TbRBP3-Interaktionpartner in T. brucei zu finden, blieben erfolglos. Versuche, um die Rolle dieses Proteins festzustellen werden durchgeführt. Spezifische Sequenzen, die sich in der 3-UTR von stadiumspezifischen Genen befinden, sind an mRNS Stabilität und Translation beteiligt. In dieser Arbeit wurden regulierende Elemente identifiziert, die an der Entwicklungskontrolle des Aminosäuretransporters 11 beteiligt sind. Die Region zwischen nt 290-618 dieser 3'-UTR ist für die geringere Abundanz der mRNS eines CAT Reportergens in der Blutstromform verantwortlich. Außerdem wurden noch zwei Elemente gefunden, die in translationelle Repression verwickelt sind. Versuche, um AATP 11-3’-UTR-Interaktionsproteine unter physiologischen Konditionen zu finden, waren erfolglos. Experimente unter in vitro Bedingungen werden vorgeschlagen.

Translation of abstract (English)

Trypanosoma brucei, the agent causing African trypanosomiasis or sleeping sickness, constitutes one of the best-studied biological models so far. In order to adapt to different environments, this parasite mainly regulates gene expression by post-transcriptional mechanisms such as mRNA stability and translation. These processes are mediated by the interaction of sequences located in the 3’-UTR with trans acting factors. RRM-proteins are involved in many aspects of the RNA metabolism. However, the function of most of them is unknown. The first part of this work deals with the characterisation of RBP3 and its role in developmental control of gene expression. Orthologues of this protein are found in T. cruzi, T. congolense and L. major. Over-expression and depletion of TbRBP3 by RNAi suggest a stage-specific role for this protein in bloodstream cells. Microarray studies comparing wild-type cells with cells where TbRBP3 levels have been perturbed (either by RNAi or over-expression) were unsuccessful in revealing putative mRNA targets, suggesting that this protein is not involved in control of mRNA levels. Pull down of TbRBP3-RNP complexes allowed the identification of several transcripts that selectively bind this protein. Specifically, the interaction of cyclin F-box and ZFP-mRNAs was confirmed by RT-PCR and the role of the over-expression of TbRBP3 at mRNA levels was determined by Northern blot analysis. Unfortunately, attempts to identify TbRBP3 interaction partners have failed. Studies to determine the role of this protein are in progress. Specific sequences in the 3-UTR of stage-specific transcripts are involved in mRNA turnover and translation. In this work, several regulatory elements involved in the developmental regulation of the amino acid transporter 11 are reported. A region between nt 290-618 of this 3’-UTR is required to down-regulate mRNA levels of the CAT reporter gene in bloodstream forms. Moreover, the presence of 2 elements involved in translational repression was also established. Several approaches used to identify interacting proteins of the AATP 11 3’-UTR under physiological conditions were unsuccessful. Approaches using in vitro conditions are suggested.