English Title: 4Pi-Microscopy with ultra-high aperture angles

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Abstract

Durch kohärente Superposition der sphärischen Wellenfronten des Anregungs- bzw. Fluoreszenzlichts mittels zweier hochaperturiger Objektive wird in der 4Pi-Mikroskopie ein schmales Hauptmaximum mit Nebenmaxima erzeugt. Dadurch kann die axiale Auflösung auf 100nm gesteigert werden. Die Nebenmaxima müssen durch Entfaltung entfernt werden. Kritikpunkte sind die notwendige Entfaltung, sowie die geringe Signaleffizienz aufgrund der 2-Photonen-Anregung, die bislang notwendig war, um entfaltbare Daten zu erzielen. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß durch Vergrößerung des Öffnungswinkels der Objektive diese Probleme gelöst werden können: In einem 2-Photonen 4Pi-Mikroskop mit kohärenter Detektion des Fluoreszenzlichts (Typ C) werden Daten erzielt, die quasi frei von Nebenmaxima sind und nicht entfaltet werden müssen. Bei effizienter 1-Photonen-Anregung werden die Nebenmaxima so weit reduziert, daß eine Entfaltung der 4Pi-Daten möglich ist. Zusätzlicher Verzicht auf Interferenz des Fluoreszenzlichts (Typ A) ermöglicht zudem ein effizientes, vereinfachtes und kostengünstiges 4Pi-Mikroskop. Die hochaufgelöste 3D-Messung von Telomeren im Zellkern ist eine Fragestellung, die derzeit nur durch Verwendung von 4Pi-Mikroskopie mit 1-Photonen-Anregung mit einer axialen Auflösung von 100nm beantwortet werden kann. Weiterhin konnte die Effizienz eines 2-Photonen 4Pi-Mikroskops gesteigert werden, indem ein Aufbau realisiert wurde, mit dem das Signal am zweiten Ausgang des Strahlteilers genutzt werden kann. Dadurch kann das detektierte Fluoreszenzsignal nahezu verdoppelt werden.

Translation of abstract (English)

In 4Pi-Microscopy an axial resolution of 100nm is achieved by the coherent superposition of the spherical excitation and detection fields from two opposing high-aperture objectives. A narrow central maximum and accompanying sidelobes are formed. In order to form a useful image, these sidelobes have to be removed by deconvolution. Drawbacks of this method are the necessity of deconvolution and poor signal efficiency due to the 2-photon-excitation so far needed to provide sufficiently low sidelobes. The present thesis addresses these problems by increasing the aperture angle of the lenses. It is shown that an increased aperture angle can yield virtually sidelobe-free data in 2-photon 4Pi Type C Microscopy, thus rendering deconvolution unnecessary. Alternatively, it is shown that the sidelobes generated in 1-photon 4Pi-Microscopy can be reduced to the point where deconvolution is possible. Furthermore, the ultra-high aperture angles enable an efficient, simple and inexpensive 4Pi-Microscope, as it is possible to obtain data that can be successfully deconvolved, even in a Type A arrangement (i.e. without coherent detection of the emitted fluorescence light). The high-resolution (100nm) 3D-measurement of telomeres in the nucleus serves as an example of an application that is currently only possible with 1-photon 4Pi-Microscopy. Additionally, a setup is presented which allows the concurrent detection of the signal at the second output of the beam-splitter, almost doubling the detected signal.