German Title: Interaktion zwishen Glycogen-Synthase-Kinase-3 und Östrogenrezeptor-alpha in Ligand-abhängig Aktivation der Rezeptor

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Abstract

Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), a serine/threonine kinase with docking properties, regulates numerous cellular processes. Two isoforms, GSK-3alpha and GSK-3beta have been described. In vivo, GSK-3beta is the major isoform and plays a key role in the regulation of transcription factors including steroid receptors. The aim of the present work, mainly performed on the estrogen receptor-alpha (ERalpha)-positive MCF-7 human breast cancer cell line, was to unravel the role of GSK-3 regarding ERalpha function. After silencing of GSK-3alpha and/or GSK-3beta isoforms using specific siRNA sequences, increased proteasomal degradation of ERalpha was observed. The use of the proteasome inhibitor MG132 restored ERalpha protein levels in GSK-3 silenced cells, showing that GSK-3 stabilizes ERalpha and protects it from proteasomal degradation. In another approach, specific silencing of the endogenous GSK-3beta of MCF-7 cells using microRNA constructs was accompanied by down-regulation of ERalpha protein content. In these cells, ERalpha protein was rescued after overexpression of wild-type or kinase-inactive xenopus GSK-3beta, which suggests that the docking properties of GSK-3 and not the kinase activity are important for ERalpha stabilization. Then, we found that 17beta-estradiol (E2) -treatment resulted in rapid phosphorylation and consequent inactivation of cytoplasmic GSK-3. This GSK-3 phosphorylation may lead to ERalpha release from the GSK-3/ERalpha complex and ERalpha translocation into the nucleus, where it is phosphorylated at Ser-118 leading to its full activation. Upon E2 stimulation, treatment of the cells with the GSK-3 inhibitor LiCl resulted in a decrease of ERalpha phosphorylation at Ser-118. This decrease was confirmed upon silencing of GSK-3 in the nucleus and show that a nuclear active pool of GSK-3 is required for E2-induced phosphorylation of ERalpha at Ser-118. As a consequence, in GSK-3 silenced cells, E2-induced ERalpha transcriptional activity, studied by ERE-dependent luciferase reporter assays and by measuring transcription of the ERalpha-dependent target genes, pS2 and progesterone receptor, by quantitative real-time PCR, was significantly reduced. In GSK-3 silenced cells, neither Ser-118 phosphorylation nor luciferase activity was restored by use of MG132. Furthermore, overexpression of human GSK-3beta wild-type and mutants inactive towards primed substrate of the kinase in MCF-7 cells stably transfected with an ERE-controlled luciferase reporter confirmed that GSK-3 triggers E2-induced ERalpha activation and suggests that ERalpha is a non-primed substrate of GSK-3 kinase. Taken together, this newly signalling pathway depicted a dual function of GSK-3 regarding ERalpha, GSK-3 stabilises ERalpha in the cytoplasm of unstimulated cells and phosphorylates/activates the receptor in the nucleus upon E2 treatment. This permits the conclusion that GSK-3 represents a link between the rapid cytoplasmic non-genomic and the nuclear genomic actions of E2-liganded ERalpha. Finally, ERalpha signalling pathway plays a crucial role in breast cancer initiation and progression. Therefore, the regulation of ERalpha function and activity by GSK-3 may have an impact on breast cancer progression. Preliminary data from GSK-3beta immunostaining of formalin-fixed human tissue sections suggests a tendency toward an increase of GSK-3beta expression in grade 3 tumors in comparison with grade 1/2 tumors.

Translation of abstract (German)

Glycogensynthasekinase-3 (GSK-3), eine Serin/Threonin-Kinase mit Docking-Eigenschaften, reguliert zahlreiche zelluläre Prozesse. Zwei Isoformen, GSK-3alpha und GSK-3beta, wurden beschrieben. GSK-3beta stellt die Hauptform in vivo dar, sie spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation von Transkriptionsfaktoren inklusive der Steroidrezeptoren. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Rolle der GSK-3 bezüglich der Funktion von Estrogenrezeptor-alpha (ERalpha) in Brustkrebszellen zu entschlüsseln. Als experimentelles Modell wurden hauptsächlich MCF-7 Zellen, eine ERalpha-positive menschliche Brustkrebszelllinie, verwendet. Silencing von GSK-3alpha und/oder GSK-3beta durch Transfektion spezifischer siRNA-Sequenzen führte zur Degradation von ERalpha durch das Proteasom. Durch Verwendung des Proteasomeninhibitors MG132 konnten die ERalpha - Proteinspiegel in GSK-3 siRNA- transfizierten Zellen wiederhergestellt werden. Dies zeigt, dass GSK-3 den ERalpha stabilisiert und vor proteasomaler Degradation schützt. In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde endogene GSK-3beta durch Transfektion der Zellen mit microRNA - Konstrukten spezifisch ausgeschaltet; auch hier wurde das Silencing der GSK-3beta von einer Reduktion des ERalpha-Proteinspiegels begleitet. In diesen Zellen konnten die ERalpha - Proteinspiegel durch Überexpression von Wildtyp- oder Kinase - inaktiver Xenopus-GSK-3beta wiederhergestellt werden. Daraus ist zu schließen, dass die Docking-Eigenschaften der GSK-3 und nicht deren Kinaseaktivität für die ERalpha - Stabilisierung wichtig sind. Behandlung von Zellen mit 17beta-Estradiol führte zu rascher Phosphorylierung und Inaktivierung zytoplasmatischer GSK-3. Diese Phosphorylierung an GSK-3 führte zur Freisetzung von ERalpha aus dem GSK-3/ERalpha - Komplex und seine Translokation in den Zellkern. Dort wurde ERalpha durch aktive kernständige GSK-3beta an Ser-118 phosphoryliert; diese Phosphorylierung ist essentiell für die volle Aktivierung von ERalpha. Behandlung der Zellen mit dem GSK-3 Inhibitor LiCl führte zur Hemmung der E2-induzierten Phosphorylierung an Ser-118, denselben Effekt zeigte die Reduktion des GSK-3 Spiegels im Zellkern nach GSK-3 Silencing. Diese Ergebnisse belegen, dass ein nukleärer Pool aktiver GSK-3, welcher durch Behandlung der Zellen mit E2 nicht phosphoryliert und inaktiviert wird, für die E2-induzierte Ser-118 Phosphorylierung von ERalpha nötig ist. Als Konsequenz der verminderten Ser-118 Phosphorylierung in GSK-3 siRNA - transfizierten Zellen wurde eine signifikante Reduktion der transkriptionalen Aktivität des ERalpha beobachtet. Diese Aktivitätsminderung wurde sowohl durch ERE-abhängige Luziferase Reporter-Assays als auch durch Messen der Transkription der ERalpha - abhängigen endogenen Gene pS2 und Progesteronrezeptor durch quantitative Real-Time PCR nach E2-Behandlung in GSK-3 siRNA - transfizierten Zellen nachgewiesen. Weder die Ser-118 Phosphorylierung an ERalpha noch die ERalpha-Aktivität konnte durch Inkubation von GSK-3 siRNA - transfizierten Zellen mit MG132 wiederhergestellt werden, was die Bedeutung der nukleären GSK-3 für diese Prozesse unterstreicht. Weiterhin konnte durch Überexpression humaner GSK-3beta in stabil mit einem ERE-kontrollierten Luziferase Reportergen transfizierten MCF-7 Zellen die Funktion der GSK-3 bei der E2-induzierten Aktivierung von ERalpha bestätigt werden. Durch Expression von GSK-3beta - Mutanten, welche gegenüber geprimten GSK-3 - Substraten inaktiv sind, wurde gezeigt, dass ERalpha ein nicht-geprimtes Substrat für GSK-3 darstellt. Der in dieser Arbeit neu beschriebene GSK-3 / ERalpha – Signalweg zeigt, dass GSK-3 einen dualen Effekt auf die Funktion des ERalpha ausübt. In nicht-stimulierten Zellen wird ERalpha im Zytoplasma durch GSK-3 stabilisiert. Nach Stimulation mit E2 transloziert ERalpha in den Zellkern, wo er durch eine kernständige aktive GSK-3 phosphoryliert und aktiviert wird. Die Befunde erlauben die Schlussfolgerung, dass GSK-3 ein Bindeglied zwischen den schnellen nicht-genomischen, im Zytoplasma ablaufenden Prozessen und den im Zellkern ablaufenden genomischen Reaktionen des Liganden-aktivierten ERalpha darstellt. Der ERalpha-Signalweg spielt eine kritische Rolle bei der Initiation und Progression von Brustkrebs. Deshalb stellt sich die Frage nach der Regulation von Funktion und Aktivität des ERalpha durch GSK-3 bei diesen Prozessen. Erste vorläufige Ergebnisse aus immunhisto-chemischen GSK-3beta – Färbungen an Formalin-fixierten Gewebeschnitten menschlicher Mammakarzinome sprechen für eine vermehrte GSK-3beta Expression in niedrig differenzierten (Grad 3) Tumoren im Vergleich zu gut bzw. mäßig differenzierten (Grad 1/2) Tumoren.