German Title: Identifizierung und Charakterisierung Xenopus Paraxiale Protocadherin

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Abstract

Die Gastrulation ist einer der entscheidenden Schritte der Embryogenese. Eine wachsende Anzahl von Proteinen, die zur Regulation der Gastrulation beitragen ist in den letzen Jahren identifiziert worden. Eines dieser Proteine ist das Xenopus Paraxiale Protocadherin (xPAPC). xPAPC kann die C-Cadherin-vermittelte Zelladhäsion modulieren und ist an der Trennung von Zellpopulationen beteiligt. xPAPC besitzt zusätzlich Signalfunktionen, welche für die Regulation von convergenten Extensionbewegungen (CE) und der Gewebstrennung während der Gastrulation notwendig sind. xPAPC beeinflusst die GTPase Rho und die C-jun terminale Kinase (JNK), welche Effektoren des planaren Polaritäts (PCP) Signalwegs sind. Die zytoplasmatische Domäne von xPAPC (xPAPCc) ist für diese Signalfunktion unabdingbar. Dennoch sind bisher keine Proteine identifiziert worden, die mit xPAPCc interagieren und die Signale intrazellulär vermitteln. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 3 Strategien zur Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die mit xPAPCc interagieren angewandt mit dem Ziel, den Mechanismus der xPAPC-vermittelten Signalkette aufzuklären. Während ein „Kandidatansatz“ und eine GST-pull-down Strategie keine befriedigenden Ergebnisse lieferten, wurden einige potentielle Interaktionpartner durch einen Yeast-Two- Hybrid Ansatz identifiziert. Zwei dieser Proteine, Sprouty1(Spry1) und Casein Kinase 2(CK2) wurden funktionell charakterisiert. Die physikalische Interaktion von xPAPCc mit diesen Proteinen wurde durch Co- Immunopäzipitations Experiment bestätigt. Die Interaktion von xPAPCc und Spry1 ist nicht von einer konservierten Region von 16 Aminosäuren abhängig, welche in allen 4 PAPC Homologen der Wirbeltiere vorhanden ist, sondern von der Phosphorylierung der Serine 741 und 955. xPAPC antagonisiert funktionell Spry1 im Kontext von CE Bewegungen und bei der Gewebstrennung. Spry1 inhibiert die Membranrekrutierung der PCP Komponenten Protein Kinase delta (PKCdelta) und Dishevelled (dsh). Koexpression von xPAPC kann die durch Spry 1 inhibierte Membranlokalisierung von PKCdelta und dsh retten. Die Interaktion von xPAPC und Spry1 ist für die Fähigkeit von xPAPC Spry1 zu antagonisieren essentiell. XPAPC Protein in dem S741 und S955 Reste mutiert sind kann nicht mehr an Spry1 binden und es nicht mehr antagonisieren. Diese Arbeit zeigt klar, dass die Interaktion von xPAPC und Spry1 für die Modulation des PCP Signalwegs ist. xPAPC vermittelte Signale stimulieren CE Bewegungen und Gewebstrennung. Durch diese Ergebnisse ist es erstmals möglich eine Verbindung zwischen Protocadherinen und nicht-canonischen Wnt-Signalwegen in Wirbeltieren herzustellen. Diese Arbeit zeigt auch, dass xPAPC den Wnt/-Catenin Signalweg modulieren kann. CK2 stimuliert den Wnt/-Catenin Signalweg durch die Stabilisierung von -Catenin. xPAPC antagonisiert CK2im Xenopus Achseninduktionstest und hemmt die Expression von des Wnt Ziegens xnr-3 in animalen Kappen Explantaten. Zusammenfassend kann xPAPC als „Schalter“zwischen canonischem und nicht-canonischem Wnt Signalweg angesehen werden. Durch die Bindung von Spry und CK2 kann xPAPC nicht-canonische Wnt Signale verstärken und so die Gastrulationsbewegungen modulieren. Gleichzeitig wird der canonische Wnt- Signalweg gehemmt, was einen Einfluss auf die Spezifizierung des Mesoderms hat.

Translation of abstract (English)

Gastrulation is one of the most crucial steps in early embryogenesis. A growing number of proteins contributing to the regulation of vertebrate gastrulation have been identified. Among them is Xenopus Paraxial Protocadherin (xPAPC). xPAPC modulates C-cadherin mediated cell adhesion and is involved in cell sorting. In addition it has signaling functions which are essential for convergent extension (CE) movements and tissue separation during gastrulation. xPAPC modulates the activities of Rho GTPase and c-jun-terminal kinase (JNK), which are effectors of the planar cell polarity (PCP) pathway. The cytoplasmic domain of xPAPC (xPAPCc) is indispensable for the signaling activities of xPAPC but until now no proteins have been reported to interact with xPAPCc and mediate intracellular signaling. In this thesis three experimental strategies were employed to identify interaction partners of xPAPCc, with the aim to elucidate the mechanisms underlying xPAPC signaling. While candidate and GST pull-down approaches did not show satisfactory results, several putative interacting partners were revealed by yeast two-hybrid screen. Two proteins, Sprouty1 and CK2, were characterized functionally. By coimmunoprecipitation assay the physical interaction of these two proteins with xPAPCc was verified. The interaction between xPAPCc and xSprouty is not dependent on the conserved 16 amino-acid region present in all four vertebrate PAPC homologs but on the phosphorylation of S741 and S955 residues of xPAPC. xPAPC functionally antagonizes xSpry in both CE movements and tissue separation. Mechanistically, xSpry1 inhibits membrane recruitment of the PCP components PKC and Dsh. Coexpression of xPAPC can rescue the recruitment of PKC and Dsh inhibited by xSpry1. Importantly, the interaction of xPAPC and xSpry1 is indispensable for the ability of xPAPC to antagonize xSpry1. xPAPC mutant in S741 and S955 residues is unable to bind and functionally antagonize xSpry1. This study therefore demonstrates clearly that the interaction between xPAPC and xSpry1 is crucial for the modulation of PCP pathway. xPAPC-mediated signaling promotes CE movements and tissue separation. This finding establishes for the first time a link between protocadherins and noncanonical Wnt signaling in vertebrates. This study also demonstrates that xPAPC modulates Wnt/-catenin signaling. CK2 stimulates the Wnt/-catenin pathway by stabilization of -catenin. xPAPC functionally antagonizes xCK2 in the Xenopus axis induction assay and inhibits the induction of Wnt target Xnr3 in animal cap explants. In conclusion, I propose that xPAPC acts as a switch between canonical Wnt and noncanonical Wnt signaling. By sequestration of Sprouty and CK2, xPAPC promotes non-canonical Wnt signaling to modulate gastrulation movements while it inbibits canonical Wnt signaling to modify mesoderm specification.