German Title: Molekulare Komponenten des Zyklus synaptischer Vesikel in Haarzellen

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Abstract

Hair cells (HCs) of the zebrafish inner ear act as sensory receptors for both auditory and vestibular stimuli, and have glutamatergic ribbon synapses.We have identified and positionally cloned two mutants that interfere with HC synaptic activity from an ENU mutagenesis screen for vestibular dysfunction in zebrafish (Nicolson et al., 1998 and unpublished results). We find that the comet gene encodes the lipid phosphatase synaptojanin 1 (synj1). comet mutant larvae display a balance defect that increases in severity when challenged, suggesting fatigability, perhaps due to insufficient SV recycling.We have sequenced three alleles of comet/synj1, all of which encode severe truncations that presumably lead to functional null phenotypes. We confirm the expression of synj1 in the CNS and, in addition, show expression in HCs of the ear by in situ hybridization. Morpholino-mediated suppression of the short splice variant of synj1, synj1-145 inefficiently generates a balance defect that is dissimilar to that of the comet mutant. Morpholino knockdown of Synj1 produces a phenocopy. At the electron microscopy level, comet/synj1 mutants show a decrease in synaptic ribbon diameter that accompanies a reduced number of ribbon-associated synaptic vesicles. This can be interpreted as evidence for altered release kinetics and ribbon maintenance in comet mutants. We also describe the completely novel phenotype for loss of synj1, basal membrane blebbing. Basal blebbing is stimulation-dependent in comet/synj1 mutants and the absence of synaptic exocytosis in comet/gemini double mutants that lack the synaptic Ca2+ channel cav1.3 (Sidi et al., 2004) abolishes blebbing. In addition, interference with endocytosis by exposing larvae to Latrunculin A phenocopies blebbing in wild-type HCs. Furthermore, we have identified vesicular glutamate transporter 3 (vglut3) as critical for HC function from the asteroid mutant strain. asteroid mutant larvae are deaf and display a profound balance defect, while hair-bundle morphology and FM 1-43 dye uptake appear normal. This phenotype suggests a transmission failure downstream of mechanotransduction. By inducing an early frameshift, the genomic lesion of the asteroid mutant results in a protein null phenotype. We can replicate this phenotype by morpholino-mediated knockdown of vglut3 in the wild-type. Unlike in mammals, vglut3 appears to be exclusively expressed in HCs of the ear and lateral line organ in the zebrafish. Restriction of Vglut3 to HCs and absence in the asteroid mutant were confirmed by immunohistochemistry. asteroid mutants show a 60% decrease in the number of ribbon-associated synaptic vesicles at the ultrastructural level, while ribbon diameters are comparable to the wild-type. This indicates a role for Vglut3 in synaptic vesicle biogenesis and/or trafficking, but Vglut3 is not the sole component required for these processes. Using in situ hybridization, we also detect vglut1 transcript in HCs, but the presence of vglut1 does not compensate for loss of vglut3 under the conditions tested, and qPCR data indicates that neither vglut1 nor vglut3 are significantly upregulated in asteroid/vglut3 mutants. In conclusion, we have identified, cloned and characterized two “novel” genes that are required for proper HC synaptic transmission. Both synj1 and vglut3 are involved in SV generation and recycling and their investigation should aid further elucidation of these mechanisms in future studies.

Translation of abstract (English)

Haarzellen im Innenohr von Zebrafischen fungieren als Sinnesrezeptoren für auditorische und vestibuläre Stimuli. Haarzellen kodieren Information über glutamaterge Bandsynapsen, an welchen im Vergleich mit anderen chemischen Synapsen der höchste Umschlag synaptischer Vesikel stattfindet. Wir haben zwei Mutanten aus einem ENU Mutageneseverfahren für vestibuläre dysfunction in Zebrafischen (Nicolson et al., 1998; nicht publiziert) identifiziert und positionell kloniert, die die synaptische Aktivität von Haarzellen behindern. Wir haben zum einen den vesikulären Glutamat Transporter 3 (vglut3) identifiziert, der kritisch für Haarzellfunktion in asteroid Mutanten ist. Larven der asteroid Mutante sind taub und haben eine offensichtliche Störung des Gleichgewichtssinns, wobei Haarzellbündelmorphologie und die Aufnahme von FM 1-43 normal erscheinen. Dieser Phänotyp deutet auf ein Versagen der Signalweiterleitung unterhalb des Mechanotransduktionsschritts hin. Durch Klonierung und Sequenzierung des asteroid Mutantenallels IJ001 wurde uns eine Mutation in der Donorspleissstelle in Exon 2 von asteroid/ vglut3 offenbar, die in einem stark verkürzten Proteinprodukt resultiert. Wir können den asteroid Phänotyp durch die Injektion von Antisense-morpholinos gegen den Translationsstart von vglut3 oder die in der Mutante betroffene Donorspleissstelle in Eier des Wildtyps kopieren. Im Gegensatz zu Ergebnissen, die aus Experimenten mit Saugern gewonnen wurden, zeigt in situ Hybridisierung für vglut3 im Zebrafish Exprimierung ausschliesslich in Haarzellen des Ohrs und des Seitenlinienorgans. Dementsprechend markieren Antikörper gegen Vglut3 ausschliesslich das basale Ende von Haarzellen, können durch Antigen blockiert werden, und die Markierung ist in asteroid/ vglut3 Mutanten nicht vorhanden. Dennoch finden wir, dass auf der ultrastrukturellen Stufe die Zahl Bandassoziierter synaptischer Vesikel in asteroid Mutanten um lediglich 60% reduziert sind (12.8 ± 1.0 SVs, WT, 5.34 ± 0.6 Mutante). Der Banddurchmesser war zwischen asteroid Mutante und Wildtyp vergleichbar. Dies deutet darauf hin, dass vglut3 an der Biogenese und/ oder dem Transport synaptischer Vesikel beteiligt ist, wenn auch Vglut3 nicht der einzige Faktor ist, der für diese Prozesse notwendig ist. In unserer in situ Hybridisierung detektieren wir auch vglut1 Transkript in Haarzellen, aber die Anwesenheit von vglut1 kompensiert unter unseren Testbedingungen nicht für den Verlust vglut3s. Dafür sprechen auch unsere qPCR-daten, die zeigen dass vglut1 in asteroid/vglut3 Mutanten nicht signifikant hochreguliert ist. Aus dem oben genannten Mutationsverfahren haben wir auch die comet Mutante isoliert. Wir haben bestimmt, dass comet die Lipidphosphatase synaptojanin 1 (synj1) codiert. Larven der comet Mutante haben eine Gleichgewichtsstörung, die mir der Zeit an schwere zunimmt, was eine vielleicht auf insuffizientes SV recycling zurückführbare Ermüdbarkeit suggeriert. Wir verwenden den Zebrafisch-comet-Stamm um mehr über die Mechanismen, denen das recycling synaptischer Vesikel in Haarzellen unterliegt, herauszufinden. Wir haben dazu drei Allele von comet/synj1 sequenziert, die allesamt starke Verkürzungen des Proteins kodieren, was vermutlich zu einem Protein-null Phänotypen in den Mutanten führt. Wir bestätigen die Exprimierung von synj1 im zentralen Nervensystem mittels in situ Hybridisierung und zeigen darüberhinaus Exprimierung in den Haarzellen des Ohrs. Interessanterweise können den Gleichgewichtsdefekt der comet Mutante durch Morpholino-knockdown der kurzen Spleissvariante von synj1, synj1-145 kopieren. Injektion eines translationsblockierenden Morpholinos gegen synj1 hingegen kopiert comet. Auf der elektronenmikroskopischen Ebene zeigen comet/synj1 Mutanten eine Verkleinerung des Durchmessers des synaptischen Bands (Mutante: 293 ± 83.4 nm vs. WT: 408 ± 108 nm), die von einer Reduzierten Anzahl Band-assoziierter synaptischer Vesikel begleitet wird (Mutante: 21.9 ± 12.3 vs. WT: 36.2 ± 6.4). Dies kann als Hinweis auf eine Veränderung in der Ausschüttungskinetik und Bandzusammensetzung in comet Mutanten interpretiert werden. Wir beschreiben auch den völlig neuen Phänotyp für einen Verlust synj1’s, blebbing der Basalmembran. Basales blebbing tritt in comet/synj1 Mutanten stimulationsabhängig auf (26.3 ± 7.5 unstim. vs. 42.6 ± 24.4 post stim.), und die Abwesenheit von synaptischer Exozytose in comet/gemini Doppelmutanten, denen der synaptische Ca2+ Kanal cav1.3 (Sidi et al., 2004) fehlt, unterdrückt blebbing. Für eine Abhängigkeit des Blebbings von der Endozytose spricht auch, dass wir, wenn wir in Wildtyp-Larven mittels Latrunculin A mit der Endozytose interfererieren, blebbing in Haarzellen verursachen. Zusammenfassend haben wir zwei für normale Mechanotransmission benötigte “neue” Gene kloniert und charakterisiert. Sowohl Synj1 als auch Vglut3 sind in die Generation und im Recycling synaptischer Vesikel involviert und weitere Forschung über diese Moleküle sollte bei der Aufklärung dieser Prozesse hilfreich sein.