German Title: Mps1-abhängige Phosphorylierung des Kinetochor-Proteins Ndc80 ist ein intrinsischer Schritt in der Aktivierung des Spindel Kontrollpunkts

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Abstract

The kinetochore is a multi-protein complex which supports chromosome segregation in mitosis by mediating the connection between centromeric DNA and the mitotic spindle. In addition, it serves as a docking platform for the spindle checkpoint proteins. The spindle checkpoint is a surveillance mechanism which monitors the proper assembly of the mitotic spindle apparatus. It allows the transition from meta- into anaphase only if all kinetochores are bipolarly attached to the spindle microtubules and if tension across the spindle is applied. The tetrameric Ndc80-complex (Ndc80, Nuf2, Spc24, Spc25) is part of the kinetochore. It is highly conserved and was shown to be required for the spindle checkpoint in S. cerevisiae (Janke et al. 2001). The kinase Mps1 has also been implicated in spindle checkpoint control (Hartwick et al. 1996). In mammalian cells, the kinetochore localisation of Mps1 depends on the presence of the Ndc80-complex (Stucke et al. 2004). Furthermore, endogenous Mps1 was found as a faint Coomassie-stained protein band in a Ndc80-complex pull down from yeast (C. Jaeger, unpublished results). Based on these observations, the goal of the present studies was to elucidate whether components of the S. cerevisiae Ndc80-complex are phosphorylated by Mps1 and if this phosphorylation has an influence on the regulation of the spindle checkpoint. The following observations were made: 1. Mps1 physically interacts with Ndc80 ∑ Mps1 weakly associates with the kinetochore by ChIP-analysis in S. cerevisiae. ∑ Mps1 physically interacts with the Ndc80-complex after spindle checkpoint activation by Mps1-overexpression. ∑ Mps1 specifically interacts with the conserved, globular N-terminus of Ndc80 in vitro. 2. Mps1 phosphorylates Ndc80 ∑ Mps1 phosphorylates the N-terminus of Ndc80 in vitro. ∑ Ndc80-phosphorylation depends on Mps1 in vivo. 3. Ndc80-phosphorylation activates the spindle assembly checkpoint ∑ Ndc80 in its non-phosphorylated state (ndc8014A) is checkpoint deficient. ∑ constitutive pseudo-phosphorylation of Ndc80 (ndc8014D) causes lethality due to a permanently activated spindle checkpoint (cell cycle arrest in mitosis). This checkpoint activation specifically depends on the checkpoint proteins Mad2 and Bub1. fi Ndc80-phosphorylation by Mps1 is an integral step in the spindle checkpoint pathway! 4. The kinetochore of ndc8014D-cells is functional ∑ The expression levels and the kinetochore localisation of the ndc8014D protein are comparable to the wild-type protein. ∑ The ndc8014D-protein is able to compete with the wild-type protein for binding-sites at the kinetochore. ∑ the spindle in ndc8014D-cells is under tension, a state which can only be achieved in the presence of an intact kinetochore. fi the observed checkpoint activation is specifically caused by the introduced point mutations rather than by a general kinetochore defect. 5. Mps1-activity is required downstream of Ndc80 ∑ The ndc8014D mutant is unable to activate the spindle checkpoint in Mps1-depleted cells. fi Mps1 has a second function in spindle checkpoint activation downstream of Ndc80-phosphorylation which might involve the phosphorylation of the checkpoint protein Mad1. The results which were obtained in the current work provide evidence that Mps1 specifically phosphorylates Ndc80 and that Ndc80-phosphorylation is a mechanism by which the spindle checkpoint is activated in the presence of unattached kinetochores in early stages of mitosis. The functional characterisation of Ndc80-phosphorylation allows for a refinement of the current model of the spindle assembly checkpoint (Figure 32).

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Das Kinetochor ist ein Multiprotein Komplex, der die Chromosomen-Segregation in der Mitose vermittelt, indem er die Verbindung zwischen Centromer-DNA und der mitotischen Spindel herstellt. Darüber hinaus fungiert das Kinetochor als Plattform für die Proteine des Spindel Checkpoints. Der Spindel Checkpoint ist ein Kontrollmechanismus, der den korrekten Aufbau der mitotischen Spindel überwacht. Er lässt den Übergang von der Meta- in die Anaphase nur zu, wenn alle Kinetochore bipolar an Spindel-Mikrotubuli angeheftet sind und wenn die Spindel unter Spannung steht. Der tetramere Ndc80-Komplex (Ndc80, Nuf2, Spc24, Spc25) ist Teil des Kinetochors. Er ist hoch konserviert und wird für den Spindel Checkpoint in S. cerevisiae benötigt (Janke et al. 2001). Neben dem Ndc80-Komplex wurde auch die Kinase Mps1 mit dem Spindel Checkpoint in Verbindung gebracht (Hartwick et al. 1996). In Säugerzellen ist die Kinetochor Lokalisation von Mps1 abhängig von der Anwesenheit des Ndc80-Komplex (Stucke et al. 2004). Darüber hinaus wurde endogenes Mps1 als schwache Coomassie-gefärbte Proteinbande in einer Aufreinigung des Ndc80-Komplex aus Hefe gefunden (C. Jaeger, nicht publizierte Daten). Basierend auf diesen Beobachtungen war das Ziel der vorliegenden Arbeit herauszufinden, ob Komponenten des S. cerevisiae Ndc80-Komplex von Mps1 phosphoryliert werden und ob diese Phosphorylierung die Aktivität des Spindel Checkpoints reguliert. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 6. Mps1 interagiert physisch mit Ndc80 ∑ Mps1 assoziiert schwach mit dem Kinetochor in S. cerevisiae (ChIP-Analyse). ∑ Mps1 interagiert physisch mit dem Ndc80-Komplex in vivo nach Spindle Checkpoint Aktivierung durch Mps1-Überexpression. ∑ Mps1 bindet spezifisch an den konservierten, globulären N-Terminus von Ndc80 in vitro. 7. Mps1 phosphoryliert Ndc80 ∑ Mps1 phosphoryliert den N-Terminus von Ndc80 in vitro. ∑ Die Phosphorylierung von Ndc80 ist abhängig von Mps1 in vivo. 8. Ndc80-Phosphorylierung aktiviert den Spindle Assembly Checkpoint ∑ Ndc80 in seiner nicht-phosphorlierten Form (ndc8014A) ist Checkpoint defizient. ∑ konstitutive Pseudo-Phosphorylierung von Ndc80 (ndc8014D) verursacht einen lethalen Phänotyp aufgrund eines permanent aktivierten Spindel Checkpoints (Zellzyklus-Arrest in der Metaphase). Diese Checkpoint-Aktivierung ist spezifisch abhängig von den Checkpoint Proteinen Mad2 und Bub1. fi Ndc80-Phosphorylierung durch Mps1 ist ein integraler Schritt im Spindle Checkpoint! 9. Das Kinetochor von ndc8014D-Zellen ist funktional ∑ Die Protein-Level und die Kinetochor Lokalisation des ndc8014D-Proteins sind vergleichbar mit dem Wildtyp Protein. ∑ Das ndc8014D-Protein ist in der Lage, mit dem Ndc80-Wildtyp Protein um Bindungsstellen am Kinetochor zu kompetitieren. ∑ Die Spindel in ndc8014D-Zellen steht unter Spannung, ein Zustand, der nur in Anwesenheit eines intakten Kinetochors erreicht werden kann. fi die beobachtete Spindel Checkpoint Aktivierung wird spezifisch durch die eingeführten Punktmutationen ausgelöst und nicht durch ein defektes ndc8014D-Protein. 10. Mps1-Aktivität wird „downstream“ von Ndc80 benötigt ∑ in Mps1-depletierten Zellen ist die ndc8014D Mutante nicht in der Lage, den Spindel Checkpoint zu aktivieren. fi Mps1 hat neben der Ndc80-Phosphorylierung eine zweite Funktion im Zusammenhang mit der Aktivierung des Spindel Checkpoints, welche die Phosphorylierung des Checkpoint Proteins Mad1 beinhalten könnte. Die Resultate, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit erzielt werden konnten, liefern Hinweise darauf, daß Ndc80 spezifisch von Mps1 phosphoryliert wird und daß die Ndc80-Phosphorylierung der Mechanismus ist, durch den der Spindel Checkpoint in der Anwesenheit von freien Kinetochoren aktiviert wird. Die funktionale Charakterisierung der Ndc80-Phosphorylierung erlaubt eine Verfeinerung des heutigen Modells des Spindel Assembly Checkpoint (Figure 32).