German Title: Einfluß der Expression von mutierten B-Typ Laminen auf die Architektur und Funktion des Zellkerns

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Abstract

The work presented here demonstrates new insights into the assembly mechanisms of the nuclear lamina. By generation and expression of several lamin mutants in mammalian cells it was possible to analyze the influence of distinct lamin domains on cellular localization and their assembly properties. Both partial and complete head deleted lamin B2 localized to the nuclear rim but highly impaired nuclear shape indicating that the head domain is dispensable for nuclear envelope localization and however, important for efficient lamin assembly. In contrast, tail deleted lamin B2 mutants did not incorporate into the nuclear rim and were distributed throughout the cytoplasm and the nucleoplasm. This suggests that the tail domain contains those elements that are necessary for effectively guiding these lamins to the nuclear envelope. However, tailless mutants did not impair the formation of a nuclear lamina. An exhaustive mutation trial of the individual mitotic phosphoacceptor sites flanking the central rod domain from serine to aspartic acid was performed in order to test if this would still allow the integration of these mutants into the nuclear lamina and if this would lead to the disassembly of the nuclear lamina. Notably, the mutant proteins were not incorporated into the lamina at all but instead they formed intranuclear aggregates when expressed in U2OS cells. Interestingly, the effect of nuclear aggregate formation was independent of both the position of the mutated site and the number of sites mutated. Live cell imaging experiments showed that the aggregates are rather dynamic structures that are able to fuse and occupy single large lamin territories. Co-transfection studies of “mitotic” lamin B1, “mitotic” lamin B2 and NLS-vimentin suggest that the aggregates are deposited in the interchromosomal domain compartment (ICD). However, intermingling of the proteins was not observed. Extraction experiments revealed that the aggregates were rather loosely connected to the nuclear matrix. Although the mechanism underlying aggregate formation of “mitotic” lamin B1, “mitotic” lamin B2, and NLS-vimentin remains elusive, our results strongly suggest the existence of nuclear “protein processing centers”. Their functions may relate to the prevention of macromolecular crowding as well as to the organization and distribution of nuclear proteins in general. Wild type and mutant lamins were also expressed in mouse embryonic stem (ES) cells. Their ability to differentiate into all specialized cell types found in the adult mouse and the exhibition and maintenance of a normal diploid complement of chromosomes make them a valuable tool for cell biological studies. As expected, both wild type lamin B1 and wild type lamin B2 localized to the nuclear rim. The stem cell status of the cells was not affected. Expression of lamin B2 deletion mutants in mouse ES cells showed similar effects as those observed in U2OS cells suggesting that lamin proteins are similarly processed and assembled into the nuclear lamina in both differentiated and ES cells. Additionally, a novel nonsense mutation in the lamin A gene (pR321X) cosegregating with dilated cardiomyopathy and cardiac rhythm disturbances was analyzed in both cultivated cells and cardiac tissue of affected patients. Neither nuclear abnormalities nor reduced expression of the wild type protein was observed. In line with a strong nonsense-mediated mRNA decay (NMD), i.e. the NMD-dependent reduction in the relative amount of mutant mRNA, the truncated protein was not found. The potential transient presence of this mutant protein could be uncovered, however, by inhibition of the proteasomal system. It is therefore suggested that NMD is not sufficient to completely prevent the expression of truncated lamin A and that even trace amounts of it may negatively interfere with structural and/or regulatory functions of lamin A/C eventually leading to the development of cardiomyopathy.

Translation of abstract (German)

Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit liefern neue Einblicke in die Assembly-Mechanismen der Kernlamina. Die Herstellung und Expression verschiedener Lamin-Mutanten in Kulturzellen ermöglichte es, den Einfluss bestimmter Lamin-Domänen auf Assembly-Eigenschaften und zelluläre Lokalisation der Proteine zu untersuchen. Lamin B2 mit teilweise oder komplett deletierter Kopfdomäne lokalisierte an der Kernhülle. Dennoch ließ die veränderte Kernmorphologie in diesen Zellen vermuten, dass die Kopfdomäne zwar für eine Lokalisation an der Kernhülle entbehrlich, jedoch für ein intaktes Lamina-Assembly notwending ist. Schwanz-deletierte Lamin B2 Mutanten hingegen wurden nicht in die Kernhülle eingebaut und verteilten sich sowohl über Zytoplasma als auch Nukleoplasma. Diese Schwanz-Domäne enthält also vermutlich jene Sequenzen, die wichtig sind für den Transport des Proteins an die Kernhülle. Die Schwanz-deletierten Mutanten beeinflussten jedoch nicht die Bildung der Lamina. Wir vermuteten, dass Mutationen der Phosphoakzeptor-Stellen vor und hinter der „Rod“-Domäne von Serin nach Aspartat (die die mitosespezifischen Phospho-Serin-Gruppen imitieren) entweder die Integration der Mutanten in die Kernlamina verhindern oder zu deren Auflösung führen würden. Tatsächlich konnten diese Mutanten nicht in die Kernlamina eingebaut werden, und bildeten anstatt dessen intranukleäre Aggregate in U2OS Zellen aus. Erstaunlicherweise war diese Aggregatbildung unabhängig sowohl von der Position der Mutation als auch von der Anzahl mutierter Phosphoakzeptor-Stellen. Mit Lebendbeobachtung konnte gezeigt werden, dass diese Aggregate sehr dynamische Strukturen darstellen, die fusionierten und große Lamin-Territorien bildeten. Kotransfektionen dieser „Mitose“-Lamine B2 und B1 mit NLS-Vimentin ließen darauf schließen, dass die Aggregate im Interchromatin-Kompartiment abgelagert werden. Dennoch konnten wir keine Vermischung der transfizierten „Mitose“-Lamine mit NLS-Vimentin beobachten. Zwar sind die Mechanismen, die zur Aggregation und getrennten „Deponierung“ dieser Proteine führen, unbekannt, unsere Ergebnisse lassen aber auf die Existenz nukleärer „Protein-Prozessierungs-Zentren“ schließen. Diese könnten das lokale Entstehen zu hoher Proteindichten (aufgrund der starken Überexpression) verhindern, oder auch generell mit der Organisation und Verteilung von Kernproteinen in Beziehung stehen. Sowohl Wildtyp als auch mutierte Lamine wurden ebenfalls in embryonalen Stammzellen der Maus exprimiert. Die Fähigkeit zur Differenzierung in alle möglichen Zelltypen und ihr intakter diploider Karyotyp machen diese Zellen für zellbiologische Studien sehr wertvoll. Wie erwartet lokalisierten Wildtyp Lamin B1 und Lamin B2 an der Kernhülle, und der Stammzellcharakter der Zellen wurde durch ihre Expression nicht beeinflusst. Die Expression von Lamin B2 Deletionsmutanten in Mausstammzellen zeigte sehr ähnliche Ergebnisse wie in U2OS Zellen. Vermutlich liegen daher in Stammzellen wie in differenzierten Zellen die gleichen Prozessierungs- und Assembly-Mechanismen für die Kernlamina vor. Des Weiteren wurde eine neu charakterisierte Mutation des Lamin A/C Gens (pR321X) untersucht, die mit dilatierter Kardiomyopathie und Herzrhythmusstörungen einhergeht. Kulturzellen und Herzgewebe betroffener Patienten zeigten weder Veränderungen der Zellkerne, noch eine verminderte Expression des Wildtyp-Lamin A Proteins. In Übereinstimmung mit der Theorie des „Nonsens-mediated decay“ (NMD) wurde kein mutiertes Protein nachgewiesen. Dennoch konnte mit Hilfe von Proteasomen-Inhibitoren gezeigt werden, dass das mutierte Protein kurzzeitig angereichert wurde. Wir vermuten, dass der NMD nicht effizient genug ist, um die trunkierte Lamin A-Mutante vollständig abzubauen. Vermutlich sind auch Spuren dieser Mutante ausreichend, um strukturelle und/oder regulatorische Funktionen von Lamin A/C zu beeinträchtigen, was letztlich zur Ausbildung der Kardiomyopathie führt.