English Title: Studying the assembly kinetics of intermediate filaments using vimentin

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Abstract

In dieser Arbeit wurde die Wachstumskinetik der in vitro Filamentebildung des Intermediärfilamentproteins Vimentin untersucht, und versucht diese quantitativ zu beschreiben. Als Grundlage dienten bestehende qualitative Beschreibungen der Filamentbildung. Das Protein Vimentin wurde rekombinant in E. coli hergestellt und über Säulenaustauschchromatographie gereinigt und in 8 M Harnstoff- Puffer gelagert. Die Renaturierung von Vimentin vor den Versuchen erfolgte durch ein Dialyseverfahren gegen Pi-Puffer (2 mM Na-Phosphat, pH 7.5). Schon während der Dialyse bilden sich zuerst Vimentin-Dimere gefolgt von Tetrameren. Nach der Dialyse liegt Vimentin als Tetramer im Pi-Puffer vor, was mit Hilfe der analytischen Ultrazentrifuge kontrolliert wurde. Um die Wachstumskinetik zu messen wurde die Salzkonzentration im Pi-Puffer auf 100 mM KCl erhöht. Dadurch beginnen die Vimentin-Tetramere lateral zu assoziieren und es entstehen ”Unit-Length- Filamente” (ULFs) aus acht Tetrameren. Diese ULFs können dann longitudinal zu langen Filamenten zusammenwachsen. ImVerlauf des Längenwachstums findet gleichzeitig eine Kompaktierung des Filaments statt. Diese radiale Kompaktierung konnte in dieser Arbeit nochmals bestätigt werden. Das Längenwachstum per Zeiteinheit wurde zuerst mit Hilfe des Elektronen- und Rasterkraftmikroskops (EM & SFM) untersucht. Im EM wurde das Wachstum nach definierten Zeitschritten durch Zugabe von Glutaraldehyd gestoppt. Im SFM dagegen wurde die Reaktion durch Verdünnen stark verlangsamt und dasWachstum durch Adsorption an eine Oberfläche endgültig beendet. Durch Bildanalyse wurde die Längenverteilung der Filamente auf den resultierenden Bilderserien bestimmt. Zudem wurde der Einfluss der eingesetzten Oberflächen (kohlebeschichtete Kupfernetze im EM sowie Glimmer und Glas im SFM) charakterisiert und die Ergebnisse miteinander mit Hilfe statistischer Methoden verglichen. Dadurch konnte bestätigt werden, dass eine kinetische Messung des Filamentwachstums auf diese Weise möglich ist und dass die Resultate aus den EM und SFM Messungen miteinander verglichen werden dürfen. Da mit Hilfe der Mikroskope insbesondere das lateraleWachstum vom Tetramer hin zum ULF innerhalb der ersten Sekunden nicht aufgelöst werden konnte, wurde diese Phase des Filamentwachstums mit einem ”Stopped-Flow”-Gerät untersucht. Hierbei wurde das Vermischen der Reaktionslösungen mit Hilfe eines Computers gesteuert, wodurch eine Beobachtung der Reaktion nach wenigen Millisekunden möglich war. Der Verlauf der Reaktion wurde mit Hilfe von Laserlichtstreuung gemessen. Zusätzlich wurden verschiedene kinetische Modelle auf Grundlage der bestehenden qualitativen Betrachtungen zum Filamentwachstum entwickelt. Aus diesen Modellen wurde ein Modell ermittelt, das die Messdaten am besten beschreibt. Durch mathematische Anpassung dieses Modells konnte dann eine erste qualitative Beschreibung derWachstumskinetik von Vimentin vorgeschlagen werden, die quantitativen Daten optimal wiedergibt. So konnte an dieser Stelle bestätigt werden, dass ULFs tatsächlich zum Filamentwachstum beitragen müssen und längere Filamente durch End-zu-End Fusion zusammenwachsen. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit eine, im Gegensatz zur Polymerisation von Aktin und Tubulin, neue Form des Filamentwachstums beschrieben werden, bei dem das Wachstum zuerst durch eine laterale Assoziation mit anschließender longitudinalen Verlängerung gekennzeichnet ist.

Translation of abstract (English)

In this work the growth kinetics of the intermediate filament (IF) protein vimentin was studied in vitro to develop a first quantitative description of the assembly reactions involved. An already existing qualitative model of the IF assembly provided a basis for the approach taken in this thesis. The protein vimetin itself was expressed recombinantely in E. coli and purified using ion-exchange columnchromatography and stored in 8 M urea-buffer. The protein was renatured prior to the experiments by dialysis against Pi-buffer (2 mM Sodium-Phosphat, pH 7.5). During the dialysis vimentin forms dimers followed by the formation of tetramers. These vimentin tetramers are the soluble species in the Pi-buffer after finishing the dialysis, which was checked by analytical centrifugation. Filament growth was initiated by raising the salt concentration in the Pi-buffer to 100 mM KCl. This leads to a first lateral aggregation of eight vimentin tetramers. The complex of eigth tetramers is termed ”unit-length-filament” or ULF. These ULFs are then able to drive the longitudinal elongation of the filaments. During the elongation process the filaments also compact radially to form the observed 10 nm diameter. This compaction could also be observed during the experiments in this work. The longitudinal elongation was recorded using electron- and scanning force microscopy (EM and SFM) after distinct time steps of filament growth. The elongation of the filaments was stopped by the addition of glutaraldehyde (EM) or through rapid dilution and adsorption to a solid support (SFM). The resulting image series were analysed and the length distribution of the generated filaments was measured. In addition the influence of the different solid supports (carbon coated EM grids, mica and glass) on the measured length distribution was characterized and the results were compared to each other using statistical means. In this way it was verified that a kinetic analysis of the images is feasible and that it is valid to match the EM and SFM results directly. However, using the mircroscopes could not resolve first lateral assembly reactions of tetramers forming ULFs. To investigate this fast kinetic process a ”stopped-flow” device was used. Here the solutions are rapidly mixed using computer controlled mechanized syringes which enables an observation of the reaction after a few milliseconds. The course of the assembly reaction was followed by laserlightscattering. In addition to the actual measurements, kinetic models were developed on the basis of the existing qualitative description. Employing these models differentmodes of filament assembly could be tested against the actual data. In this way a model which is able to describe the measurements was found. By fitting this model to the experimental data first reaction rate constants were calculated and a qualitative description of the assembly process was introduced. This model also confirmed the previously introduced qualitative description of IF assembly in general but also with regards to ULFs beeing a major intermediate for filament growth as well as the elongation of longer filaments by end to end fusion. This thesis therefore presents a new type of filament elogantion which, in contrast to the polymerisation of actin and tubulin, proceeds in amulti-step process characterized by a lateral aggregation phase which is followed by longitudinal growth.