English Title: HDAC inhibitor-induced sensitization of HPV-positive cervical carcinoma cell lines to death-receptor-mediated apoptosis

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Abstract

Die wichtigsten Vorraussetzungen für die Expansion von Tumoren sind uneingeschränkte Proliferation und die Fähigkeit, Apoptose zu umgehen. In vorangegangenen Studien der Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass HDAC-Inhibitoren, wie z.B. Natriumbutyrat, in der Lage sind, beides anzugreifen - die ungehinderte Proliferation und die Apoptosehemmung - indem sie Wachstumsarretierung und eine ausschließlich intrinsische Apoptose in HPV-positiven Zervixkarzinomzellen induzieren. In dieser Arbeit wurde der experimentellen Beweis erbracht, dass die Zervixkarzinomzelllinie HeLa, die vollständig resistent gegenüber der TNFa und TRAIL-vermittelten Apoptose war, durch Inhibition der HDAC-Aktivität gegenüber beiden Todesliganden sensibilisiert werden konnte. Zusätzlich wurde auch die CD95L-induzierte Apoptose durch HDAC-Inhibition signifikant erhöht. Die Suppression der anti-apoptotischen Proteine c FLIPL und c-FLIPS wurde als ursächliches Ereignis für die Apoptose-Sensibilisierung identifiziert. Bisher wurde vermutet, dass NF kB an der transkriptionellen Aktivierung von c FLIP beteiligt ist. Hemmung der HDAC-Aktivität führte zu einer signifinkanten Verringerung sowohl der konstitutiven als auch der induzierbaren NF kB DNA-Bindungsaktivität, die sich eindeutig dem NF-kB-Protein p50 zuordnen ließ. Allerdings konnte die HDAC-Inhibitor-induzierte NF-kB-Hemmung als Ursache für die c-FLIP-Suppression, unter anderem durch die Verwendung von siRNA gegen NFKB1, ausgeschlossen werden. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch die HDAC-Inhibition weder ein transkriptioneller c-FLIP-Repressor induziert, noch ein für die Transkription essentieller Faktor degradiert wurde. Hemmung des proteasomalen Abbaus ergab zum einen, dass die reduzierten c-FLIP-Proteinmengen nicht ausschließlich auf eine transkriptionelle Repression, sondern auch auf eine zusätzliche proteasomale Degradation zurückzuführen waren. Zum anderen wurde dabei deutlich, dass die beiden c-FLIP Isotypen auf Proteinebene unterschiedlich reguliert wurden, wobei sich für c FLIPS eine präferenziell proteasomale Degradation herausstellte. Für den synergistischen Effekt zwischen HDAC-Inhibition und TNFa-Stimulation erwies sich die Anwesenheit von HPV als Vorraussetzung, denn in HPV-negativen Zellen und nach Depletion von HPV durch siRNA fand keine Apoptose-Sensibiliserung statt. Für Zervixkarzinome sind Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) beschrieben worden, die stets mit einer schlechten klinischen Prognose und einer Tumorprogression in Verbindung gebracht werden. Hier konnte jedoch gezeigt werden, dass das von primären aktivierten Makrophagen sezernierte TNFa in konditioniertem Medium ausreicht, um in HeLa Zellen nach HDAC-Inhibition Apoptose zu induzieren. Die Verwendung von HDAC-Inhibitoren könnte somit die TAMs ausnutzen, um Tumorzellen effektiver zu eliminieren. HDAC-Inhibitoren scheinen nach diesen Resultaten vielversprechene Krebstherapeutika darzustellen. Sie können als direkte Agenzien eingesetzt werden, um Wachstumsarretierung und intrinsische Apoptose zu induzieren. In Kombination mit Todesliganden - rekombinant oder sezerniert von TAMs - weisen sie einen synergistischen Effekt auf und verringern in Tumorzellen den Schwellenwert der Apoptose-Induktion um ein Vielfaches.

Translation of abstract (English)

Infinite proliferation and capability to evade apoptosis are important prerequisites for expansion of tumour cells. HDAC inhibitors (HDACi) have been identified as agents that are able to attack both, proliferation and apoptosis resistance by inducing growth arrest and intrinsic apoptosis in HPV-positive cervical carcinoma cells. Here, I present experimental evidence that the cervical carcinoma cell line HeLa, which is known to be completely resistant to TNFa- or TRAIL-induced apoptosis, can be rendered sensitive to both death receptor ligands after HDAC inhibition. Additionally, the amount of CD95-mediated apoptosis is further increased by pre-treatment with HDACi. Overexpression studies have clearly proved that HDACi-induced suppression of anti-apoptotic c-FLIP proteins represents the causal event for this sensitization. NF kB was described to stimulate c FLIP expression. Yet, HDACi significantly inhibited constitutive and induced NF-kB DNA binding activity, for which p50 was identified as the causative molecule. However, siRNA directed against NFKB1 and recovery experiments excluded NF kB inhibition as reason for transcriptional down-regulation of c-FLIP. Furthermore, I could definitely exclude an HDACi mediated induction of a transcriptional c-FLIP repressor as well as the degradation of a factor which might be essential for c-FLIP expression. Inhibiting the proteasome clearly demonstrated that reduced c-FLIP protein levels were not only due to transcriptional repression but also due to an additional c-FLIP protein degradation. In addition, these experiments showed that c-FLIP proteins in untreated cells are differentially controlled: half-life of c-FLIPS is dependent on the proteasome, while c-FLIPL half-life is not. It should be noted that the synergistic effect of a combined HDACi/TNFa treatment in eradication of cervical cancer cells is not observed in the absence of HPV, despite c-FLIP was also found to be down-regulated, pointing to the role of HPV to be essential for sensitization. For many cervical tumors tumour associated macrophages (TAMs) have been described. However, TAMs are always associated with a bad clinical prognosis and cancer progression. Here, I could provide evidence that TNFa of primary activated macrophage-conditioned medium was sufficient to induce apoptosis after HDAC inhibitor pre-treatment at the same range as recombinant TNFa. Therefore, with the help of HDAC inhibitors, presence of TAMs could even be beneficial in eradicating cervical cancer cells. Taken together, these results support the notion that HDACi are promising cancer therapeutics since they do not only induce growth arrest and intrinsic apoptosis, but in combination with death receptor ligands, exhibit a synergistic effect and lower to a high extent the apoptotic threshold within tumour cells.