German Title: Fluoreszent-markierte Zell-penetrierende Peptide

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Abstract

Peptide-based fluorescent reporters of enzyme activity in living cells have been proposed to complement, or provide alternatives to, genetically-encoded probes, such as those based on the Green Fluorescent Protein and its colourful variants. The use of well-established chemical methodologies – especially solid phase synthesis – and the vast array of fluorescent dyes available allow the preparation and the evaluation of compounds with different specificities, making a wide range of investigations possible. However, cell uptake of these compounds is generally poor, and normally requires invasive methods such as microinjection or electroporation. In these conditions, the usefulness of these probes can be severely limited. The discovery of the so-called cell-penetrating peptides (CPPs), more than ten years ago, has actually revealed that some of these compounds can cross efficiently the cell membranes and are able to deliver hydrophilic cargoes, such as DNA, proteins or even nanoparticles inside the cell. Unfortunately, much of the initial enthusiasm dissipated when it was found that endocytosis plays a major role in the uptake process. The entrapment in endosomal vesicles may in fact impose strict limits in terms of modification and degradation of the cargo of interest. This thesis describes the synthesis of fluorescent peptides and focuses on the problem of their delivery into the cytoplasm of living cells. A negatively charged peptide corresponding to one of the autophosphorylation sequences of the epithelial grow factor receptor (EGFR), namely DADEY992L, was taken as an example to investigate the possibility of creating a cell-permeable fluorescent sensor for the EGFR kinase activity in living cells. The use of a conjugate of the cell-penetrating peptide Penetratin and the probe revealed an endosomal localization in one cell type, and surprisingly no uptake in a second cell line tested. Different fluorescent derivatives of Penetratin demonstrated variations in cell uptake under different experimental conditions. During this study, red fluorescent derivatives of the cell-penetrating TAT peptide were also assessed. Although they also showed predominantly accumulation in membrane-bound compartments, these appeared to be different from the endosomal vesicles. One TAT variant in particular, namely TAT(K-LRh), may be potentially exploited as a novel vector, provided that further studies will clarify unambiguously the compartment of its accumulation. To overcome the limits inherent in the use of Penetratin conjugates, a different strategy was implemented, which relied on the chemical modification of the probe with bioactivatable protecting groups. The rationale behind these modifications was to increase the hydrophobic character of the peptide and allow its diffusion into the cells. In particular, acetoxymethyl (AM) esters were used to temporarily mask the negative charges of the aspartate and glutamate residues present in the peptide sequence. These biodegradable esters are promptly removed by ubiquitous non-specific esterases present in cells. The modified fluorescent peptide was able to penetrate easily and distribute homogeneously into the cytoplasm and the nucleus of several cell lines, with a mechanism resembling passive diffusion. Unfortunately, FRET-based assays did not measure any interaction with the EGFR. In vitro analyses showed unmasking of the carboxylate groups, albeit with modifications to the peptide backbone, which may have resulted from intramolecular condensations and formation of aspartimide residues. In particular, mass spectrometry data support this model. A loss of substrate specificity may be expected to result from such modifications, which may explain why the fluorescent peptide did not appear to interact with its enzyme target despite intracellular delivery having been achieved. This work highlights the feasibility of a tailored modification of peptides, either by masking negatively charged groups as, for example, AM esters, or by conjugating to variant of the TAT peptide, for the intracellular delivery of peptidic cargoes. Further refinements may solve the problems of poor endosomal escape or backbone modifications, and may yet offer small molecule alternatives to genetically encoded probes.

Translation of abstract (German)

Fluoreszente Reporterkonstrukte zum Nachweis von Enzymaktivität in lebenden Zellen, die auf Peptiden basieren sind eine ideale Ergänzung und Alternative zu genetisch kodierten Konstrukten auf der Grundlage von fluoreszierenden Proteinen, wie das Grün-Fluoreszierende-Protein oder eine der vielen anderen Farbvarianten. Die etablierten chemischen Verfahren, wie vor allem die Festphasensynthese und eine große Außwahl fluoreszenter Farbstoffe, erlauben die Herstellung von Verbindungen mit den unterschiedlichsten Eigenschaften. Dies macht sie für den Einsatz in einer Vielzahl von Untersuchungen interessant. Das Einbringen dieser Verbindungen in lebende Zellen ist sehr schwierig und nur mit langandauernden und invasiven Methoden wie der Mikroinjektion möglich, was bisher die Anwendbarkeit stark eingeschränkt hat. Die Entdeckung von sogenannten zell-penetrierenden Peptiden (CCPs, cell-penetrating peptides) vor mehr als zehn Jahren, hat gezeigt, dass einige dieser Verbindungen die Zellmembran effizient durchdringen können. Zusätzlich konnten diese, auch angehängte hydrophile Moleküle wie DNA, Proteine oder sogar Nanopartikel mitnehmen. Von dem anfänglichen Enthusiasmus blieb wenig übrig, als man feststellte, dass Endozytose einen Grossteil dieses Effekts ausmachte. Der Einschluss in endosomale Vesikel stellt eine starke Einschränkung, vor allem in Bezug auf Modifikation und Zersetzung der einzubringenden Verbindung, dar. Die Synthese fluoreszenter Peptide und vor allem das Problem deren Einbringung in das Zytosol lebender Zellen, stehen im Mittelpunkt dieser Arbeit. An dem Beispiel des der Autophosphorylierungssequenz des Rezeptors für den epithelialen Wachstumsfaktor (EGFR, epithelial growth factor receptor) entsprechenden, negativ geladenen Peptids, DADEY992L, sollte die Möglichkeit, eine membrangängigen fluoreszenten Sensor für die Aktivität der EGFR Kinase in lebenden Zellen herzustellen, geprüft werden. Die Verwendung eines Konjungats aus dem zell-penetrierenden Peptid Penetratin und der Sonde, führte zur Aufnahme in Endosomen in einem Zelltyp, während in einem weiteren getesteten Zelltyp überhaupt keine Aufnahme nachzuweisen war. Auch konnte mit verschiedenen fluoreszenten Penetratinderivaten gezeigt werden, wie die Aufnahme in Zellen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen variierte. Während dieser Untersuchung, wurden auch rot-fluoreszierende Derivate des zell-penetrierenden TAT-Peptids analysiert. Obwohl diese auch eine Akkumulation in vorwiegend membran gebundenen Kompartimenten aufwiesen, erschienen diese jedoch anders als endosomale Vesikel. Speziell die TAT-Variante TAT(K-LRh) könnte sich als neuer Vektor erweisen, wenn aufgeklärt werden kann in welchen Zellkompartimenten dieses Peptid akkumuliert. Um die, bei der Verwendung von Penetratin, auftretenden Einschränkungen zu überwinden, wurde eine Strategie verfolgt, die auf einer chemischen Modifikation der Sonde mit bioaktivierbaren Schutzgruppen basiert. Das Grundprinzip war, den hydrophoben Charakter des Peptids zu verstärken, um so die Diffusion durch die Zellmembran zu ermöglichen. Insbesondere wurden Azetoxymethylester (AM) verwendet um die negativen Ladungen der in dem Peptid vorkommenden Aspartat- und Glutamatreste zu maskieren. Diese bioaktivierbaren Ester werden sofort durch unspezifische Esterasen, die in allen Zellen vorkommen, abgespaltet. Die fluoreszent markierten Peptide durchdrangen leicht die Plasmamembran, vergleichbar mit passiver Diffusion, und verteilten sich homogen im Zytosol und Nukleus in verschiedenen getesteten Zelllinien. Leider konnte durch FRET keine Interaktion der Peptide mit dem EGFR nachgewiesen werden. In vitro Analysen ergaben, dass die Karbonatgruppen entschützt werden konnten, wenngleich dieses zu Modifikationen des Peptidrückgrats durch intramolekulare Kondensation und die Bildung von Aspartimidresten geführt haben könnte. Durch diese Modifikationen ließe sich der Verlust der Substratspzifität und somit die fehlende Interaktion mit der Kinase erklären, obwohl das Peptid in die Zelle eingebracht werden konnte. Diese Arbeit hebt die Machbarkeit der Einbringung Peptiden in lebende Zellen durch massgeschneiderte Modifikationen, entweder indem negativ geladenen Gruppen durch AM oder andere hydrolisierbare Ester maskiert werden, oder indem sie mit einem der TAT-Peptide konjugiert werden, hervor. Durch weitere Verfeinerung der Verfahren könnten die auftretenden Probleme, wie Einschluß in Vesikel oder das Auftreten von Modifikationen des Peptidrückgrats, gelöst werden und so eine Alternative zu den viel größeren genetisch Kodierten Sonden bieten.