German Title: Experimentelle Stochastik in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie : Bildtheorie zur PALMIRA Mikroskopie; verbesserte Modelle zu FCS

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Abstract

This thesis presents a statistical imaging theory for photo-activation localization microscopy with independently running acquisition (PALMIRA). In this type of sub-resolution microscopy the switching of the fluorescence capability of macromolecules reduces imaging to the high-precision localization of individual fluorescent molecules. The point-spread function and the imaging equation of a PALMIRA imaging system are calculated and stochastic expressions for the measurement time and the confidence level of the image as a function of the spatial resolution are provided. Different localization schemes like astigmatic imaging, multi-channel defocus imaging, 4pi imaging and a multi-point setup using photo-diodes are analyzed. The theory for multi-color and polarization-resolved measurements is addressed and estimators for data evaluation procedures are provided. The role of background noise in producing artefacts is studied. Finally, it is assessed whether the quality of images can be augmented by a suitable deconvolution procedure. Furthermore, stochastic methods are applied to solve a couple of persistent problems in fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The development of computational methods for the simulation of FCS experiments necessitates the analytical description of the architecture of a multiple-lag-time correlator that is used to estimate autocorrelations from intensity time traces. Recently, FCS has been combined with stimulated emission depletion (STED) focal volumes. The general phenomenology of STED-FCS correlation curves is studied as a function of the STED beam intensity. It is shown that the quality of a measurement is mainly determined by the fraction of signal originating from the focal plane. Then, an improved fit model taking into account the exact spatial dependency of intersystem crossing rates is presented and tested on synthetic data. Finally, the influence of second-order correlations among the points of the FCS curve on the determination of fit parameters is studied. Analytical results are provided wherever possible. Otherwise, Monte-Carlo computations are performed.

Translation of abstract (German)

In dieser Arbeit wird eine statistische Theorie zur Bildentstehung in der PALMIRA-Mikroskopie vorgestellt. Die Schaltbarkeit der Fluoreszenz passender Makromoleküle hat den Effekt, mikroskopische Bildentstehung auf das Lokalisieren von Einzelmolekülen zurückführen zu können. Dabei kann die Abbesche Beugungsgrenze überwunden werden. Die Punktabbildungsfunktion sowie die Bildgebungsgleichung werden berechnet. Zudem werden stochastische Ausdrücke für die Aufnahmezeit und die Konfidenz des Bildes als Funktion der räumlichen Aufl¨osung hergeleitet. Verschiedene Methoden zur dreidimensionalen Positionsbestimmung von Fluorophoren - astigmatische, defokussierte und 4pi-Abbildung - und ein zweidimenionaler Mehrpunktaufbau aus Photodioden werden analysiert. Die Theorie f¨ur Mehrfarben-Messungen und für olarisationsabhängige Mikroskopie wird entwickelt und die Rolle von Hintergrundrauschen bei der Objekterkennung wird diskutiert. Eine Entfaltungstrategie wird vorgestellt. Weiterhin werden stochastische Methoden eingesetzt, um Probleme auf dem Gebiet der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zu behandeln. Die Entwicklung von numerischen Verfahren zur Simulation von FCS-Experimenten erfordert es, die Theorie eines multi-lag-time Korrelators analytisch zu formulieren. FCS wurde kürzlich mit den grössenreduzierten Fokalvolumina der STED-Mikroskopie kombiniert. Die Phänomenologie von STED-FCS Korrelationskurven wird in Abhängigkeit von der STED-Intensität studiert. Hierbei zeigt sich, dass die Qualität der Messung entscheidend durch die Grösse des Signals aus der Fokalebene bestimmt ist. Weiterhin wird ein verbessertes Fitmodell für Übergangsraten in die Triplet-Mannigfaltigkeit, das den exakten geometrischen Fokalverlauf berücksichtigt, vorgeschlagen und an synthetischen Daten getestet. Schliesslich wird untersucht, inwieweit die nicht-diagonale Kovarianz von FCS-Korrelationskurven das Fitergebnis von Standardverfahren verfälscht und ob ein detaillierteres Fitverfahren hier Abhilfe schaffen kann. Wo immer möglich werden analytische Resultate hergeleitet, andernfalls empirische Monte-Carlo-Rechnungen verwendet.