German Title: Analyse der physiologischen Funktion des TNF Rezeptor I Associated Death Domain Proteins (TRADD) und des Familial Cylindromatosis Proteins (CYLD) durch konditionelles „Gene Targeting“ in Mäusen

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Abstract

The aim of the project was to apply the conditional gene targeting approach based on the usage of Cre/LoxP system of site-specific DNA recombination to investigate physiological function of two putative mediators of inflammation – TNF Receptor 1 Associated Death Domain Protein (TRADD) and Familial Cylindromatosis Protein (CYLD), in a mouse model. TRADD is an adaptor molecule postulated to be essential for signal transduction through TNF Receptor 1 (TNFR1). The in vivo physiological role of TRADD has not been determined so far. CYLD is a tumor suppressor that has been described as a negative regulator of TNFR1-mediated signaling and signaling by Toll like Receptors (TLRs). TLRs are essential components of mammalian innate immunity belonging to a group of sensors that directly recognize bacterial and viral products as well as markers of tissue stress. Upon activation TLRs induce intracellular signaling events leading to production of cytokines, chemokines and other mediators that promote protective responses. Tumor Necrosis Factor (TNF) is a pleiotropic cytokine produced by a variety of cells upon TLR stimulation. It plays a key role in the amplification of the initial immune response. The majority of effects that are induced by TNF are dependant on TNFR1. TLR signaling and TNF signaling through TNFR1 share common mechanism of negative regulation that is based on the the removal of K63-linked polyubiquitin chains from specific key components of receptor-associated complexes. Two de-ubiquitinating enzymes – A20 and CYLD are currently known to be responsible for this process. The physiological function of A20 is well characterized by gene knockout studies while the precise role of CYLD remains enigmatic. We successfully generated mice carrying “floxed” (modified by the insertion of LoxP sites and extra DNA fragments at specific locations) alleles of TRADD and CYLD by using homologous recombination in embryonic stem cells. In case of TRADD the deletion of the LoxP-flanked sequence would generate a null TRADD allele; in case of CYLD the last exon of the gene would be replaced by a mutated copy resulting in the expression of C-terminally truncated form of CYLD that is lacking catalytic activity. We then generated TRADD knockout and CYLD complete mutant mice by crossing the homozygous “floxed” animals to a ubiquitous Cre-Deleter strain. By analyzing TRADD knockout mice we could observe that TNFR1-mediated apoptosis was completely blocked in these mice while TNF-induced pro-inflammatory and anti-bacterial responses were dramatically reduced but still present. We obtained similar results by evaluating the response of TRADD deficient primary cells to TNF. To our surprise we discovered that TRADD knockout mice had impaired immediate responses to stimulation of Toll like receptors 3 and 4. Consistent with this observation TRADD deficient primary cells demonstrated reduced cytokine production as well as impaired activation of NF-kB and MAP kinases upon stimulation with poly(I:C). On the basis of co-expression experiments performed in HEK293T cells we propose that TRADD is recruited to TLR adaptor TRIF via Receptor-Interacting Protein 1 (RIP1) and acts as a mediator of TRIF-dependant TLR signaling. To our surprise CYLD homozygous mutant mice did not survive until the age of weaning. By carefully following the pups we observed that the mutants died within minutes after birth showing signs of cyanosis and respiratory distress. Mutant pups were smaller then control littermates and demonstrated altered morphology of the tail. We then produced mutant mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and analyzed the response of these cells to cytokines. Consistent with the role of CYLD as a negative regulator of pro-inflammatory signaling, mutant cells showed elevated activation of NF-kB and JNK cascades upon stimulation with TNF and IL-1beta

Translation of abstract (German)

Das Ziel dieser Studie war die physiologische Funktion von zwei mutmaßlichen Inflammationsmediatoren – TNF Receptor 1 Associated Death Domain Protein (TRADD) und Familial Cylindromatosis Protein (CYLD) – in Mausmodelsystemen zu erforschen. Hierfür wurde die Methode des konditionellen „Gene Targetings“ angewandt, welches auf der zielgerichteten Rekombination der DNA durch das Cre/LoxP Systemberuht. Von dem Adapter Molekül TRADD wird angenommen, dass es für die Signaltransduktion durch TNF Rezeptor 1 (TNFR1) essentiell ist. Die physiologische Rolle von TRADD wurde in vivo bisher noch nicht bestimmt. CYLD ist ein Tumorsuppressor, der TNFR1- und Toll like Receptor (TLR) vermittelte Signale inhibiert. TLRs sind essentielle Sensoren des unspezifischen Immunsystems, die sowohl bakterielle und virale Produkte als auch Stressmarker erkennen. Werden TLRs aktiviert, so führt dies zu einer intrazellulären Signaltransduktionskaskade, die die Produktion von Zytokinen, Chemokinen und anderen Mediatoren als Schutzantwort bewirkt. Tumor Nekrose Faktor (TNF) ist ein vielseitiges Zytokin, das von verschiedenen Zelltypen zur Antwort auf TLR-Stimulation hergestellt wird. TNF spielt eine Schlüsselrolle in der Verstärkung der initialen Immunantwort. Der Großteil der TNF vermittelten Effekte ist von TNFR1 abhängig. Die von TLR- und TNFR1- vermittelten Signalkaskaden haben einen negativen Regulationsmechanismus gemeinsam. Dieser beruht auf der Abspaltung K63 verbundener Polyubiquitinketten von rezeptorassoziierten Schlüsselkomponenten. Bisher sind zwei deubiquitinierende Enzyme – A20 und CYLD – bekannt, die für diesen Prozess verantwortlich sind. Während die physiologische Funktion von A20 durch Inaktivierung des Gens gut charakterisiert wurde, ist die genaue Rolle von CYLD noch rätselhaft. Uns ist es durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen gelungen, Mäuse zu generieren, die „gefloxte“ (modifiziert durch die Insertion von LoxP Sequenzen und zusätzlicher DNA Fragmente an spezifischen Positionen) Allele von TRADD und CYLD tragen. Im Falle von TRADD ergibt die Deletion der LoxP flankierten Sequenz ein TRADD Nullallel; im Fall von CYLD wird das letzte Exon durch eine Variante ersetzt, die zur Expression einer C-terminal verkürzten Form von CYLD führt, die keine katalytische Aktivität mehr besitzt. Die Kreuzung homozygot „gefloxter“ Tiere mit einem generellen CRE-Deleter Stamm ergab dann Nachkommen, denen entweder TRADD vollständig fehlte, oder in denen das Wildtyp CYLD durch das mutierte CYLD ersetzt war. Die Analyse der TRADD knockout Mäuse ergab, dass die TNFR1-vermittelte Apoptose in diesen Tieren vollständig blockiert war, wohingegen die TNF-induzierte proinflammatorische und antibakterielle Antwort zwar dramatisch reduziert, aber prinzipiell vorhanden war. TNF-Behandlung von TRADD defizienten Zellkulturen zeigte ähnliche Ergebnisse. Überraschenderweise war die frühe Immunantwort nach Stimulation von TLR3 und TLR4 in TRADD knockout Mäusen eingeschränkt. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung war die verminderte Zytokinproduktion und eingeschränkte Aktivität von NF-kB und MAP Kinase nach poly(I:C) Stimulation in TRADD defizienten Zellen. Basierend auf den Ergebnissen von Koexpressionsexperimenten in Hek293T Zellen nehmen wir an, dass TRADD via RIP zum TLR Adapter TRIF rekrutiert wird und als Vermittler in der TRIF-abhängigen TLR Signalübertragung agiert. Mäuse, die homozygote Träger des mutierten CYLD Allels waren, starben überraschenderweise innerhalb von Minuten nach der Geburt mit Zyanose- und Atemnotsymptomen, wobei die Tiere mit mutiertem CYLD Gen kleiner als Wildtypmäuse waren und eine veränderte Schwanzmorphologie aufwiesen. Deshalb analysierten wir die Reaktion auf Zytokinstimulation in mutierten embryonalen Mausfibroblasten. In den Zellen mit mutiertem CYLD war erhöhte NF-kB und JNK Aktivität nach TNF und IL-1b Stimulation feststellbar, was mit einer Funktion von CYLD als negativer Regulator der proinflammatorischen Signalvermittlung im Einklang steht.