English Title: Functional relevance of the ubiquitin-ligases seven in absentia homologue (SIAH)-1 and SIAH-2 in the human hepatocarcinogenesis

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Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der häufigste primäre maligne Tumor der Leber; es geht mit einer sehr schlechten Prognose einher. Neben der Dysregulation von Syntheseprozessen stellt auch der alterierte proteasomale Abbau von Proteinen durch Ubiquitin-Ligasen einen potentiellen protumorigenen Mechanismus dar. Der wichtigste Prozess zur Degradation von Zielstrukturen in eukaryontischen Zellen ist die Ubiquitin-26S-Proteasom-vermittelte Degradation durch die mehr als 80% aller zellulären Proteine spezifisch und energie-abhängig abgebaut werden. Für die E3-Ubiquitin-Ligasen seven in absentia homologue (SIAH)-1 und SIAH-2 wird der durch Polyubiquitylierung vermittelte Abbau verschiedener funktioneller und struktureller Klassen von Proteinen, wie β-Catenin und Synaptophysin, bewirkt. In unabhängigen Studien konnte eine Reduktion SIAH-1 Expression in HCCs nachgewiesen werden, was einen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit dieser Bindepartner im Rahmen der Lebertumorentstehung oder Progression vermuten lässt. Ziel dieser Studie war daher die vergleichende Analyse von SIAH-1 und SIAH-2 hinsichtlich Expression und Funktion in der humanen Hepatokarzinogenese. In einem HCC Kollektiv wurde für SIAH-1 eine Reduktion der Expression bestätigt, wohingegen keine signifikante Expressionsänderung für SIAH-2 detektiert wurde. Während in Hepatozyten eine zytoplasmatische Expression für beide E3-Ligasen nachgewiesen wurde, war eine signifikante und progressive nukleäre Akkumulation in Vorläuferläsionen und HCC Zellen zu beobachten. In HCC-Zelllinien führte die Inhibierung beider Ubiquitin-Ligasen zu einer Reduktion der Tumorzellproliferation und Migration, als auch zu einer Induktion von Apoptose. Die gleichzeitige Inhibierung beider Ligasen verstärkte die beobachteten biologischen Effekte nur geringfügig, was für nicht redundante Effekte beider Ligasen spricht. Eine Inhibierung der Ubiquitin-Ligasen führte darüber hinaus zu einer signifikanten Sensibilisierung der HCC Zellen gegenüber der Behandlung mit solchen Chemotherapeutika, welche sowohl die Stabilität des Mikrotubulusnetzwerkes verändern als auch in DNA interkalieren. Im Gegensatz zu bereits beschriebenen in vitro-Modellen konnte in den HCC Zelllinien keine Regulation von SIAH-1 durch das Tumorsuppressorgen p53 nachgewiesen werden. Überraschenderweise induzierte die Inhibierung von SIAH-1 und SIAH-2 in HCC Zellen nicht die Bioverfügbarkeit von bekannten Bindungspartnern (z.B. T-Star und β-Catenin), sondern führte zu einer verringerten Expression von far upstream sequence element (FUSE) binding protein (FBP)-Familienmitgliedern, welche zentrale Mediatoren der Tumorzellproliferation und Migration darstellen. Zusammenfassend demonstrieren diese Daten, dass das protumorigene Potential von SIAH-1 und SIAH-2 nicht durch eine veränderte (reduzierte) Expression, sondern durch nukleäre Akkumulation und durch die Aktivierung distinkter molekulare Mechanismen vermittelt wird. Aufgrund der Tumorzell-assoziierten nukleären Expression unterscheidet sich die Funktion von SIAH-1 und SIAH-2 als auch die molekularen Effektormechanismen in HCC Zellen deutlich von anderen Zelltypen. Darüber hinaus stellt die Inhibierung der subzellulären Translokation bzw. die Reduktion der nukleären Bioaktivität der SIAH-Ligasen eine neue Möglichkeit zur Sensibilisierung von Tumorzellen mit zytotoxischen Substanzen dar.

Translation of abstract (English)

The hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent malignant tumor of the liver, which comes along with a bad prognosis for the patient. Next to the dysregulation of different metabolic processes, the aberrant proteasomal degradation of target proteins by E3-ubiquitin-ligases represents a potential pro-tumorigenic mechanism in the process of tumor initiation and progression. The most important process for protein degradation in eucaryotic cells is the ubiquitin-26S-proteasom-dependent degradation, by wich more than 80% of all cellular proteins were degraded. The E3-ubiquitin-ligases seven in absentia homologue (SIAH)-1 and SIAH-2 catalyze the polyubiquitylation and subsequent degradation of different functional and structural classes of proteins like β-Catenin and Synaptophysin. Independent studies demonstrated that SIAH-1 expression is reduced in HCCs which suggests a potential protumorigenic function in hepatocarcinogenesis. The purpose of this study was the comprehensive comparative analysis of SIAH-1 and SIAH-2 concerning expression, function and therapeutic relevance in human hepatocarcinogenis. While reduced SIAH-1 levels were confirmed for SIAH-1 in HCCs, no significant changes in the expression of SIAH-2 were detected. While in normal hepatocyts a cytoplasmatic expression was detected for both E3-ligases, a significant and progressive nuclear accumulation was observed in pre-malignant lesions and HCC tissues. In HCC cell lines the inhibition of both ubiquitin-ligases by RNAinterference was associated with a reduction of the tumor cell proliferation and migration, as well as an induction of apoptosis. The combined inhibition of both ligases augmented the biological effects only moderately, strongly suggesting exclusive molecular mechanisms for both ligases. In addition, an SIAH inhibition led to a significant sensitization of HCC cells for treatment with cytotoxic substances which affect the stability of the microtuble-network as well as the DNA integrity. Although SIAH-1 was described as a p53 target gene no regulation of SIAH-1 was detected in the HCC cell lines after regulation of wildtype p53. The inhibition of SIAH-1 and SIAH-2 did not change the bioavailability of previously described target proteins (e.g. T-Star and β-Catenin), but led to a reduced expression of far upstream sequence element (FUSE) binding protein (FBP) family members, which are central mediators of the tumor cell proliferation and migration. In summary, these data demonstrate that the pro-tumorigic function of SIAH-1 and SIAH-2 are not mediated by a changed (reduced) expression level, but by nuclear accumulation and the activation of distinct molecular mechanisms. Due to the tumor cell-associated nuclear expression, the function of SIAH-1 and SIAH-2 as well as the molecular effector mechanisms significantly differ in HCC cells from other (non-tumorigenic) cell types. Furthermore, the inhibition of the subcellular translocation, and the reduction of the nuclear bioactivity of the SIAH-ligases exhibit a new therapeutic option for the sensitization of tumor cells for the treatment with cytotoxic substances.