German Title: Etablierung von einem Mausmodel für die 12R-LOX Geninaktivierung in autosomaler rezessiver kongenitaler Ichthyose

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Abstract

12R-lipoxygenase (12R-LOX) and epidermal LOX-3 (eLOX-3) are part of a recently identified eicosanoid pathway critically involved in skin terminal differentiation. Inactivating mutations in the genes of 12R-LOX and eLOX-3 are causally linked to the development of autosomal recessive congenital ichthyosis (ARCI). ARCI is an inherited skin disease associated with hyperkeratosis and impaired barrier function. To analyse the impact of 12R-LOX in epidermal barrier function and to investigate its physiological role a Cre-LoxP based mouse model for the targeted inactivation of 12R-LOX was generated in a previous study. Constitutive ablation of 12R-LOX leads to early neonatal death due to a severely impaired permeability barrier function. Disruption of barrier function is associated with ultrastructural anomalies in the upper granular layers, disordered composition of ester-bound ceramide species and impairment of profilaggrin processing but does not result in the development of a typical ichthyosiform phenotype in the neonatal skin. The main focus of this thesis was to characterize the adult phenotype of 12RLOX deficient skin by establishing skin grafts and conditional knockout models. When transplanted onto the back of nude mice 12R-LOX-/- mouse skin developed a severe adult phenotype that closely resembles that seen in ichthyosis patients, with thickening of the epidermis, hyperproliferation, hypergranulosis, focal parakeratosis and marked hyperkeratosis. In contrast to the neonatal knockout phenotype, 12R-LOX deficiency did not affect profilaggrin processing in the adult transplanted skin but rather resulted in the over-expression of fully processed filaggrin monomers and other components of the cornified cell envelope such as involucrin and repetin. In order to study the adult phenotype in more detail we established a temporally-controlled site-specific 12R-LOX knockout model by using a transgenic mouse line expressing a tamoxifen-dependent Cre recombinase under the control of the Keratin 14 promoter. In these Alox12bfl/fl/K14-Cre-ERT2 (mutant) mice, Cre-mediated Alox12b inactivation was detected upon tamoxifen treatment but also spontaneously as early as day 17 after birth in K14-expressing tissues such as epidermis, tongue, cornea and thymus. 12R-LOX ablation resulted in the development of a severe phenotype associated with growth retardation, dramatic loss of body weight and premature death. Morphological changes observed in mutant mice included focal alopecia, scaling of the skin and palmoplantar keratoderma. Histological analyses of skin biopsies confirmed the development of an ichthyosiform phenotype mimicking that observed in ichthyosis patients. Comparative gene expression profiling to identify disease-related downstream targets of the 12R-LOX/eLOX-3 pathway showed that 12R-LOX ablation is associated with deregulation of members of the activating protein-1, small proline rich protein and keratin gene families, known to be important for the epidermal differentiation. This data documents a crucial role of 12R-LOX in the establishment and maintenance of the epidermal barrier function. Moreover, 12R-LOX knockout mice may be a suitable model to investigate molecular mechanisms of the LOX pathway related to diseased phenotype as well as for the development of novel strategies towards a therapy for ARCI forms associated with impaired LOX metabolism.

Translation of abstract (German)

Die 12R-Lipoxygenase (12R-LOX) und die Epidermis-Typ Lipoxygenase-3 (eLOX3) sind Schlüsselenzyme eines neuen Stoffwechselweges in der Haut, der bei der terminalen Differenzierung eine wichtige Rolle spielt. Eine genetische Inaktivierung einer dieser beiden LOX führt beim Menschen zur Ausbildung von autosomal rezessiver kongenitaler Ichthyose (ARCI), einer vererbten epidermalen Verhornungsstörung, die mit dem Verlust der epidermalen Barrierefunktion assoziiert ist. Zur Untersuchung der physiologischen Funktion von 12R-LOX in der Haut und ihrer Rolle bei der Pathogenese von ARCI wurde in einer vorangegangenen Arbeit unter Verwendung der Cre/LoxP-Technologie ein Mausmodell für eine konstitutive und induzierbare 12R-LOX-Geninaktivierung etabliert. Der konstitutive 12R-LOXGenknockout führt in den Mäusen zu einem frühen neonatalen Tod, der auf einer massiven Beeinträchtigung der epidermalen Barriere beruht. Der Verlust der Barriere funktion geht einher mit Störungen der Filaggrin-Prozessierung und des Ceramid stoffwechsels, führt aber in der neonatalen Haut nicht zur Ausbildung eines typischen ichthyosiformen Phänotyps. Ziel meiner Arbeit war die Untersuchung des adulten 12R-LOXKnockoutphänotyps anhand von Hauttransplantaten und eines konditionellen Knockoutmodells.Nach Transplantation auf den Rücken immundefizienter Nacktmäuse bildeten die Häute der 12R-LOX-Knockoutmäuse eine vielschichtige Epidermis aus, die mit Acanthose, Hypergranulose und Hyperkeratose typische Merkmale eines ichthyosiformen Phänotyps aufweist. Im Gegensatz zum neonatalen Knockout-Phänotyp war in der transplantierten Haut keine Störung der Filaggrinprozessierung zu beobachten, viel eher eine starke Überexpression von Filaggrinmonomeren und anderer Komponenten des „Cornified Cell Envelopes“. Um den adulten Phänotyp im Detail studieren zu können, wurde unter Verwendung von K14-Cre-ERT2-Mäusen, die eine Tamoxifen-induzierbare Cre-Rekombinase unter Kontrolle des Keratin-14-Promoters exprimieren, ein Mausmodell für eine gewebspezifische und zeitlich kontrollierte Inaktivierung des 12R-LOX Gens hergestellt. In den doppeltransgenen Mutanten kam es Tamoxifenbehandlung, aber auch spontan ab einem Alter von 17 Tagen, zu einer Inaktivierung des 12R-LOXGens in Epidermis und anderen K14-exprimierenden Geweben, was mit der Ausbildung eines ausgeprägten Phänotyps assoziiert war, gekennzeichnetmakroskopisch durch Fellveränderungen mit fokaler Alopezie, einer starken Schuppung der Haut und ausgeprägte Palmoplantarkeratose sowie durch einen dramatischen Gewichtsverlust und einen vorzeitigen Tod. Histologische Analysen der Haut belegten die Ausprägung eines typischen ichthyosiformen Phänotyps. In meiner Arbeit konnte ich weiterhin durch genomweite Expressionsanalyse mittels Illumina-Bead-Arrays zeigen, dass die Deletion von 12R-LOX mit einer Deregulierung von Mitgliedern der „Activating Protein-1“ (AP-1), der „Small Proline Rich Proteins“ (SPRR) und der Keratin-Genfamilien assoziiert ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen eine essentielle Funktion der 12R-LOX für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der epidermalen Barrierefunktion. Mit der Etablierung und Charakterisierung einer konditionellen 12R-LOX-Knockout-Mauslinie habe ich ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung gestellt für weitergehende Analysen der molekularen Mechanismen des 12R-LOX/eLOX-3-Stoffwechselwegs, die für die Entstehung des Ichthyose-Phänotyps von Bedeutung sind. Das Modellsystem könnte darüber hinaus auch für die Entwicklung neuer Ansätze zur Therapie von Ichthyosen von Bedeutung sein.