German Title: "Vom Labortisch zum Krankenbett" : die Rolle Tumor-spezifischer regulierender T-Zellen bei Brustkrebs und die Erforschung der therapeutischen Modulation

Preview

PDF, English Download (2MB) | Terms of use

Abstract

This thesis characterizes the extent of regulatory T cell–mediated immune suppression in breast cancer and explores the possibilities for its potential therapeutic modulation. Based on initial results obtained from a pilot clinical study of adoptive transfer of autologous bone marrow derived T cells in advanced metastatic breast cancer patients, we observed that T-cell unresponsiveness in 53% of study patients was associated with an existing immune suppression exerted by Treg. Further IFN-γ secretion assays with primary breast cancer samples revealed that T-cell activation, proliferation as well as CTL responses upon tumour antigen stimulation were hampered when Treg were present. Flow cytometric data displayed that in primary breast cancer patients the bone marrow (BM) contained significantly lower frequencies of Treg than the peripheral blood (PB) (p<0.001), which may at least partially explain the improved functional potential of BM-derived memory T cells. Different migratory capacities of Treg in the BM and the PB were observed regarding breast cancer profiled chemokine receptors CCR2, CCR4 and CCR5, which might be responsible for this scenario. By removing Treg through CD25 targeting, the pre-existing T-cell anti-tumour immunity was evoked remarkably in both BM and PB, especially in otherwise less responding PB, as determined by IFN-γ ELISpot assay with polyvalent tumour antigens (MCF7 and KS24.22) as well as with defined tumour associated antigens (polypeptides). This rescuing effect in the PB provides an opportunity of utilizing PB instead of limited BM as a source for adoptive T cell transfer immunotherapy. As a pioneer exploitation, a large-scale Treg-depletion in a leukapheresis sample obtained from a metastatic breast cancer patient was operated with CliniMACS system under clinical-grade conditions (GMP). A sufficient depletion of Treg, a high viability of isolated cells and a satisfying recovery of total cells were documented. To exploit immunotherapy regarding eliminating Treg, an oral metronomic cyclophosphamide (CTX) treatment (50 mg/day) was performed to selectively deplete Treg in vivo. This pilot clinical trial was applied on 13 advanced metastatic breast cancer patients for 3 months. Clinical responses was observed in 64% of study patients accompanied by a rapid and effective reduction of Treg on Day14 (p=0.005) and by an augmentation of spontaneous anti-tumour T-cell immunity on Day70. Last but not least, in this thesis we found that Treg existing in breast cancer patients exhibit breast tumour antigen specificity, which was evidenced indirectly and directly. MCF7- or KS24.22-specific IFN-γ secretion was abrogated when Treg were added back in ELISpot assay. The production of immunosuppressive cytokine IL-10 was increased only when Treg encountered breast tumour antigens measured by ELISA and intracellular staining experiments. By applying a novelly designed Treg Specificity Assay, we detected a broad spectrum of tumour antigens recognized by Treg in at least 47% of tested breast cancer patients with Mammaglobin A as the most frequent one (85%).

Translation of abstract (German)

Die vorliegende Arbeit charakterisiert das Ausmaß der über regulatorische T Zellen (Treg) vermittelten Immunsuppression im Mammakarzinom und erforscht potentielle Möglichkeiten zur therapeutischen Modulation. Nach ersten Erkenntnissen einer klinischen Pilotstudie des adoptiven Transfers von autologen T Zellen aus dem Knochenmark in Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs, wurde beobachtet, dass das Fehlen einer T-Zell-Reaktivität in 53% der Studienpatientinnen mit einer existierenden Immunsuppression assoziiert war, die auf Treg zurückzuführen war. Weitere IFN-γ Sekretionstests mit klinischem Material vom primären Mammakarzinom zeigten, dass T-Zell-Aktivierung, Proliferation und zytotoxische Immunantwort nach Stimulation mit Tumorantigen unterdrückt wurden, wenn Treg präsent waren. Durchflusszytometrische Untersuchungen von primäroperierten Brustkrebspatientinnen demonstrierten, dass das Knochenmark (KM) signifikant niedrigere Treg-Frequenzen als das periphere Blut (PB) aufwies (p<0,001); dies kann zumindest teilweise die verbesserte Funktion der Gedächtnis-T-Zellen im KM erklären. In Treg aus KM und PB wurde unterschiedliches migratorisches Potential für die Mammakarzinom-relevanten Chemokinrezeptoren CCR2, CCR4 und CCR5 beobachtet, das möglicherweise für die obengenannte Beobachtung verantwortlich ist. Durch die Depletion von Treg über CD25-Targeting wurde die bereits existierende T-Zell Anti-Tumor Immunität in beiden Kompartimenten, KM und PB, bemerkenswert unterstützt; dies war im sonst nicht reaktiven PB besonders auffällig, wie IFN-γ ELISpot Tests mit polyvalenten Tumorantigenen (MCF7 und KS24.22) sowie mit definierten tumorassoziierten Antigenen (Polypeptide) demonstrierten. Diese Rettungsaktion im PB ermöglicht den Einsatz von PB anstelle von limitiertem KM als Quelle für die adoptive T-Zell-Immuntherapie. In einem Pionieransatz wurden aus einem Leukapherese-Produkt einer metastasierten Brustkrebspatientin die Treg mit Hilfe des CliniMACS Systems nach guter Herstellungspraxis (GMP) in großem Umfang depletiert. Ausreichende Treg-Depletion, hohe Vitalität der isolierten Zellen und zufriedenstellende Ausbeute an Gesamtzellen wurden dokumentiert. Auf diesen auf Treg-Depletion basierenden immuntherapeutischen Ansatz wurde näher eingegangen, indem Cyclophosphamid (CTX) metronomisch verabreicht wurde (50mg/Tag), um die Treg selektiv in vivo zu depletieren. An dieser klinischen Pilotstudie nahmen 13 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom für drei Monate teil. Klinische Antworten wurden in 64% der Studienpatienten beobachtet, die von einer schnellen und effektiven Reduktion der Treg an Tag 14 (p=0,005) und von einer Steigerung der Anti-Tumor T-Zell-Reaktivität an Tag 70 begleitet waren. Nicht zuletzt wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Treg, die in Brustkrebspatientinnen existieren, eine Spezifität für Brustkrebsantigen aufweisen; dies wurde indirekt und direkt nachgewiesen. Die MCF7 oder KS24.22 spezifische IFN-γ Sekretion wurde inhibiert sobald Treg im ELISpot Test zurückaddiert wurden. Die Produktion vom immunsuppressiven Zytokin IL-10 war nur dann erhöht, wenn Treg auf Brustkrebsantigen trafen, wie ELISA Tests und intrazelluläre Färbungen belegen. In einem neu entwickelten Treg Spezifikationstest wurde ein breites Spektrum an Tumorantigenen detektiert, das von Treg von mindestens 47% der untersuchten Brustkrebspatientinnen erkannt wurde; Mammaglobin A war dabei das am häufigsten erkannte Antigen (85%).