German Title: Adaptive Elemente in der STED-Mikroskopy

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Abstract

Modern fluorescence far-field microscopes are not resolution limited by diffraction, anymore. This property increases the impact of these microscopes for cell-biological imaging. This thesis covers methods, that considerably improve the quality of ensemble scanning microscopes, a subclass of modern fluorescence microscopes. The influence of the PSF is optimized with a spatial light modulator (SLM) in case of stimulated emission depletion (STED) microscopy to increase the resolution and the signal noise ratio of the microscope. Together with a novel error correction routine the SLM provides unrivaled flexibility and quality for the generated STED-PSF. Furthermore, a new adaptive beam scanning pattern is proposed, which shortens image acquisition time and simultaneously reduces illumination load of the sample with else unimpaired image quality. This concept is extended by another novel locally adaptive illumination method, which reduces photo bleaching, dark state transitions and phototoxic effects several factors. These effects are further decreased with better resolution. A combination of these adaptive methods enables unprecedented scan times for imaging of fast dynamic processes and enables 3D STED images previously frustrated by photo bleaching.

Translation of abstract (German)

Moderne fluoreszenz Mikroskope sind nicht mehr durch Beugung in ihrer erreichbaren Auflösung beschränkt. Diese Eigenschaft erhöht ihren Einfluss auf die Bildgebung von zellbiologischen Objekten. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Verfahren, die die Eigenschaften dieser modernen Mikroskope wesentlich verbessern. Exemplarisch an stimulated emission depletion (STED) Mikroskopie wird der Einfluss des Schaltmusters für die Auflösungserhöhung und die detektierbaren Photonen durch die Nutzung eines spatial light modulators (SLM) optimiert. Mit diesem programmierbaren Werkzeug wird eine nie dagewesene Flexibilität und Qualität des Schaltmusters erreicht. Weiterhin wurde zur effizienten Abbildung von lebenden Proben mit STED ein schnelles lokal adaptives Strahlscanverfahren entwickelt, welches die Abbildungszeit um ein vielfaches verkürzt und dabei gleichzeitig die Probe schont ohne an Bildqualität einzubüßen. Dieses Konzept wurde um ein weiteres neuartiges lokal adaptives Beleuchtungsverfahren erweitert, welches das Bleichen und phototoxische Wirkungen in den Proben um ein vielfaches reduziert. Der Schutz der Probe nimmt interessanter Weise mit der Auflösung des Mikroskops zu. Die Kombination der neuen adaptiven Verfahren erlaubt die Beobachtung schneller Lebensprozesse und ermöglicht 3D Aufnahmen, die bislang durch zu rasches Bleichen verhindert wurden.