German Title: STED Mikroskopie mit Q-switch Microchip Lasern

Preview

PDF, English Download (1MB) | Terms of use

Abstract

The far-field light microscope is a valuable scientific instrument in modern life sciences, nevertheless, its full potential was constrained by the diffraction-limited resolution. A concept exploiting a saturable optical transition of fluorescent molecules, namely stimulated emission depletion (STED), allowed to overcome this restriction and provides diffraction-unlimited resolution in far-field light microscopy. In this thesis STED microscopy as a tool in cell biology is further established by revealing the ring-like structure of the Bruchpilot protein in larval Drosophila neuromuscular junctions and clustering behavior of the nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Moreover, the performance of STED microscopes is further improved by examining photobleaching behavior of fluorescent dyes and presenting a new illumination scheme for reduced photobleaching and increased signal. For the first time a new approach to STED microscopy with a Q-switched microchip laser, replacing a Ti:Sapphire-based laser system, was successfully implemented. The applicability of this approach and an increase in resolution beyond the diffraction limit to below 25 nm is demonstrated with colloidal nanoparticles and in biological samples. The range of applicable dyes for STED microscopy is further extended into the blue regime, widening the field of possible applications.

Translation of abstract (English)

Das Lichtmikroskop ist ein wertvolles wissenschaftliches Instrument in der modernen Biowissenschaft, trotzdem war sein volles Potential durch die beugungsbegrenzte Auflösung eingeschränkt. Ein Konzept, welches einen sättigbaren optischen Übergang fluoreszenter Moleküle, nämlich stimulierte Emission (stimulated emission depletion, STED) ausnutzt, ermöglicht es, diese Begrenzung zu überwinden und bietet eine nichtmehr durch Beugung begrenzte Auflösung. In dieser Arbeit wird die STED Mikroskopie als Hilfsmittel in der Zellbiologie weiter etabliert, indem Ringähnliche Strukturen des Proteins Bruchpilot in neuromuskulären Verbindungen in Drosophila Larven, sowie das Aggregationsverhalten des nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors in Säugerzellen aufgedeckt werden. Darüber hinaus wird die Leistungsfähigkeit von STED Mikroskopen weiter verbessert, indem das Bleichverhalten fluoreszierender Farbstoffe untersucht wird. Aus diesen Ergebnissen wird ein neues Beleuchtungsschema für geringeres Photobleichen und erhöhtes Signal entwickelt. Zum ersten mal wird eine neue Herangehensweise an die STED-Mikroskopie mit einem gütegeschalteten (Q-switched) Mikrochiplaser, welcher Titan-Saphir basierende Lasersysteme ersetzt, erfolgreich umgesetzt. Die Anwendbarkeit dieses neuen Ansatzes und eine über die Beugungsgrenze hinaus erhöhte Auflösung von unter 25 nm wird an kolloidalen Nanopartikeln und in biologischen Proben demonstriert. Die Auswahl anwendbare Farbstoffe für die STED-Mikroskopie wird weiter in den blauen Bereich ausgedehnt und eröffnet dadurch neue Anwendungsmöglichkeiten.