English Title: In vivo analysis of the dynamic of COPI vesicles and p24 proteins

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Abstract

Die p24-Proteine stellen eine hochkonservierte Familie an Typ I Transmembranproteinen dar, die zwischen den Organellen des frühen sekretorischen Transportwegs zyklisieren. Sie sind als Homodimere in der Lage die Komponenten der COPI Vesikelhülle, ARF1 und Coatomer, zu binden, und somit die Vesikelbildung zu initiieren. Darüber hinaus wurden Interaktionen der p24-Proteine mit Bestandteilen der COPII Vesikelhülle beschrieben. Es ist jedoch nicht bekannt, wie eine selektive Rekrutierung der COPI Hüllproteine an Golgi-Membranen bzw. von COPII Komponenten an ER-Membranen gewährleistet wird. In einer Reihe verschiedener in vitro Studien wurde die Bildung spezifischer Heterooligomere beschrieben, wohingegen die Existenz von Homodimeren in vivo bisher noch nicht untersucht wurde. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in vivo die Bildung von Homodimeren sowohl im Golgi-Apparat als auch im ER mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Technik zu studieren. Aufgrund der gemessenen FRET-Effizienzen bilden p23, p24 und p25 zu einem erheblichen, p27 zu einem geringeren Anteil Homodimere im Golgi Apparat, wohingegen p26 ausschließlich in monomerer Form vorliegt. Diese Homodimere, sowie das im Golgi ebenfalls nachgewiesene Heterodimer aus p23 und p24, dissoziieren im ER. Darüber hinaus zeigt die Fixierung von ARF1 in seiner GDP- oder GTP-gebundenen Form, dass ARF1 keinen Einfluss auf den oligomeren Zustand von p23 und p24 ausübt. Diese Daten verdeutlichen, dass die p24-Proteine, durch ausschließlich Bildung von Homodimeren im Golgi die exklusive Rekrutierung von ARF1 und Coatomer an diese Membranen regulieren. In einem entsprechenden Modell wurden die gewonnenen Daten zusammengeführt. Ein weiteres Projekt bestand darin, ein System zur Untersuchung von COPI Vesikel in vivo zu etablieren. Dazu wurden fluoreszenzmarkierte COPI Vesikel in vitro von isolierten Ratten Leber Golgi-Membranen generiert, aufgereinigt und charakterisiert. Diese konnten aufgrund der fluoreszenzmarkierten Proteine nach Mikroinjektion in Säugetierzellen identifiziert und ihr Verhalten somit weiter verfolgt werden. Innerhalb von 30 min waren diese in der Lage, unabhängig von Mikrotubuli zum Golgi Apparat zu wandern und mit diesem zu fusionieren. Einige Vesikel, insbesondere solche die Mannosidase II enthielten, fusionierten dabei direkt mit dem Golgi und nicht mit dem ER. Die markierten, exogenen Vesikelproteine reagierten auf eine BFA-Behandlung wie endogene Proteine und konnten bezüglich ihres Verhaltens in zwei Klassen eingeteilt werden. Dieses System bietet somit in Zukunft die Möglichkeit eine Reihe ungeklärter Fragstellungen über die Funktion und das Verhalten von COPI Vesikeln in vivo eindeutiger zu untersuchen.

Translation of abstract (English)

The members of the p24-protein family constitute a highly conserved family of type I transmembrane proteins that cycle between the organelles of the early secretory pathway. They were shown to bind and recruit the components of the COPI vesicle coat, ARF1 and coatomer, in their homodimeric form and thus initiate vesicle biogenesis. Moreover, interactions between the p24-proteins and components of the COPII coat were reported. To date, however, the regulation of selective binding of COPI components to Golgi membranes and COPII components to ER membranes, respectively, has not yet been elucidated. In a series of in vitro studies, the formation of different heterooligomers was described, whereas the existence of homodimers in vivo has not yet been studied. The aim of the present work was to investigate in vivo the formation of homodimers in the Golgi as well as in the ER by utilising Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET). Based on the determined FRET-efficiencies, p23, p24 and p25 form homodimers to a great extent in the Golgi region, whereas p27 only showed weak interactions and p26 was found exclusively in its monomeric form. These homodimers, as well as the already reported heterodimer of p23 and p24 dissociate in the ER. Moreover, fixing ARF1 in its exclusively GDP- or GTP-bound state does not have an influence on the oligomeric state of p23 and p24. These findings demonstrate how p24-proteins regulate the recruitment of ARF1 and coatomer to the Golgi membrane by exclusively forming homodimers in the Golgi. The goal of a second project was to establish a method to investigate the fate and function of COPI vesicles in vivo. To this end, fluorescently labelled COPI vesicles were generated in vitro from isolated rat liver Golgi membranes. After purification and characterisation they were microinjected into mammalian cells. Due to the fluorescently labelled vesicle proteins they could unambiguously be identified and further monitored. Within 30 minutes these vesicles moved independently of microtubules towards the Golgi and eventually fused with this compartment. Some vesicles, particularly those containing Mannosidase II, fused directly with the Golgi and not with ER membranes. The labelled, exogenous proteins behaved like endogenous proteins after BFA treatment and could be classified into two different populations. This system now provides the opportunity to more unambiguously address several open questions about the fate and function of COPI vesicles in vivo.