German Title: Chromatin auf der nm-Skala - Entwicklung eines Einzelmolekül-FRET Spektrometers zur Untersuchung der Struktur und Stabilität einzelner Nukleosomen

Preview

PDF, English Download (8MB) | Terms of use

Abstract

The structure and stability of individual nucleosome complexes is analysed on the single molecule level. Both aspects are important for the organisation of chromatin inside the nucleus, e.g. by controlling the accessibility of DNA to transcription factors. On the level of individual nucleosomes in vitro experiments provide valuable information on the processes responsible for dynamic changes in the nucleosome structure. An experimental setup is presented which monitors the conformation of freely diffusing complexes. Nucleosomal DNA is labeled with small fluorophores and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) is used to monitor changes in nucleosome structure with nm accuracy. Experiments are presented in which various remodelling factors induce detectable changes in the nucleosome conformation. A major focus is laid on the stability of nucleosomes under the influence of various factors such as ionic strength, total nucleosome concentration, histone tail acetylation and the use of different DNA sequences. Nucleosomes dissociate spontaneously at low sample concentrations and sequence-specific changes in nucleosome structure occur on the ms time scale. Histone tail acetylation also results in a destabilisation of the nucleosome complex. The dissociation at larger ionic strength correlates with an opening of the overall nucleosome structure which predominantly affects the linker DNA region.

Translation of abstract (German)

Die Struktur und Stabilität einzelner Nukleosome wird im Rahmen dieser Arbeit auf Einzelmolekülebene untersucht. Beide Aspekte spielen eine entscheidende Rolle in der Chromatinorganisation im Zellkern. Sie steuern zum Beispiel die Zugänglichkeit bestimmter DNA Regionen für Transkriptionsfaktoren. Auf der Ebene einzelner Nukleosome können in vitro Experimente wertvolle Informationen über die Prozesse liefern, die dynamische Strukturänderungen innerhalb des Nukleosoms hervorrufen. Dazu wurde eine experimentelle Platform konzipiert und aufgebaut, welche es erlaubt, die Konformation frei diffundierender Nukleosome zu untersuchen. Dazu wird nukleosomale DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, und lokale Änderungen der Nukleosomstruktur durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) im Nanometer-Bereich nachgewiesen. Unter anderem werden Messungen an verschiedenen Remodellierungsfaktoren präsentiert, welche deutliche Unterschiede in der Nukleosomenstruktur hervorriefen. Ein Hauptaugenmerk wird ebenfalls auf die Stabilität einzelner Nukleosomen gelegt. Diese wurde in Abhängigkeit verschiedener Faktoren wie Ionenstärke, Gesamt-Nukleosomkonzentration, Acetylierung von Histonschwänzen, sowie Verwendung verschiedener DNA Sequenzen untersucht. Es wird demonstriert, dass Nukleosom-komplexe unter niedrigen Konzentrationen spontan dissoziieren und dabei sequenzabhängig einer Strukturänderung unterliegen. Die dabei auftretenden Konformationsänderungen weisen eine Dynamik im Millisekunden-Bereich auf und nehmen mit steigender Ionenstärke zu. Die Acetylierung der Histonschwänze wirkt sich ebenfalls destabilisierend auf die Nukleosomstruktur aus. Das erhöhte Dissoziationsverhalten korreliert mit einer Öffnung der Nukleosomstruktur, welche sich hauptsächlich in der Linker DNA Region bemerkbar macht.