English Title: Establishment and validation of quantitative proteomics techniques to identify microRNA target proteins in mantle cell lymphoma

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Abstract

MikroRNAs (miRNAs, miRs) sind endogene etwa 22 Nukleotide lange RNAs. Sie binden an Bereiche innerhalb der messenger RNAs (mRNAs) und regulieren dadurch ihre Ziele post-transkriptional. Ihre Wirkung ist dabei nur zu einem geringen Anteil die mRNA Degradation, der Hauptmechanismus besteht in der Inhibition der Translation. Es wird vermutet, dass eine miRNA bis zu 1000 Proteine beeinflusst und insgesamt über 30% der Protein-kodierenden Gene reguliert werden. Somit können miRNAs nahezu jeden zellulären Prozess beeinflussen. Anhand von miRNA-Profilen bei verschiedenen Krebsarten konnte gezeigt werden, dass miRNAs bei Krebs reguliert sind und als Onkogene und Tumorsuppressoren wirken können. Die Funktionen einer miRNA sind in deren regulierten Proteinen begründet. Um die Zielproteine von miRNAs zu identifizieren, können verschiedene Ansätze verfolgt werden. Durch bioinformatische Vorhersage-Algorithmen konnten miRNA Ziele erfolgreich detektiert werden, wobei allerdings ein hoher Prozentsatz der Vorhersagen falsch positive oder falsch negative Ergebnisse sind. Experimentell konnten durch mRNA Microarray Analysen Zielgene von miRNAs identifiziert werden, obwohl diese Methode nur solche miRNA Ziele detektieren kann, deren mRNA degradiert wird. In dieser Arbeit sollten miRNA Ziele auf Proteinebene identifiziert werden. Um dies zu ermöglichen, wurden zwei verschiedene quantitative Proteomik-Techniken eingesetzt. Bei der 2D DIGE (zweidimensionale difference in-gel electrophoresis) handelt es sich um eine Gel-basierte und bei SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture) um eine Gel-freie, massenspektrometrische Quantifizierungstechnik. SILAC erlaubt die Quantifizierung von Proteinen zweier Zellklone oder -zustände durch Markierung mit stabilen Isotopen. Der Einbau erfolgt in vivo durch Zugabe der 12C-markierten (leichten) bzw. 13C-markierten (schweren) Aminosäuren Lysin und Arginin während der Zellkultivierung. Bei der SILAC-Technik stellte sich als Problem die Arginin zu Prolin Konvertierung heraus, welche zu einer Verschlechterung der Quantifizierungsgenauigkeit führt. Die Lösung bestand darin, dass nicht markiertes Prolin zum Zellkulturmedium hinzugefügt wurde, wodurch Arginin nicht mehr in Prolin umgewandelt wird. Die 2D DIGE- und SILAC-Technik konnten anhand von miR-155 Zielproteinen verglichen werden. Aufgrund der höheren Proteomabdeckung und damit auch der höheren Anzahl durch miR-155 regulierten Proteine stellte sich die SILAC-Technik als die geeignetere Methode heraus. Des Weiteren konnte anhand der miR-155 Zielproteine erstmalig auf Proteomebene gezeigt werden, dass mikroRNA Zielproteine Zelllinien-spezifisch sind. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden die für das Mantelzelllymphom relevanten Zielproteine von miR-15a und miR-16-1 in der Granta-519 Zelllinie untersucht. Zellzyklus, Apoptose und DNA-Reparatur sind diejenigen Prozesse, die durch miR-15a und miR-16-1 Zielproteine beeinflusst werden. Diese Prozesse sind bereits in anderen Krebsentitäten durch miR-15a und miR-16-1 als reguliert beschrieben und auch einige Proteine, wie z.B. PDCD6IP, sind als potentielle miR-15a bzw. miR-16-1 Zielproteine bekannt. Eine Vielzahl der Proteine sind allerdings neue miR-15a und miR-16-1 Effektoren im Mantelzelllymphom, was durch publizierte Regulationen von Proteinen wie TCL1A, MKI67, MCM6 und MCM2 in Patientenproben bestätigt wird. In dieser Arbeit konnte quantitative Proteomik zur Identifizierung von mikroRNA Zielproteinen durch die Berücksichtigung der Zelllinien-Spezifität erstmalig mit Relevanz in Krebs auf Proteomebene eingesetzt werden.

Translation of abstract (English)

MicroRNAs (miRNAs, miRs) are endogenous, about 22 nucleotide long RNAs. By pairing to sites within messenger RNAs (mRNAs), microRNAs regulate their targets post-transcriptionally. The central action of miRNAs is translational inhibition and, only to a minor extent, the degradation of mRNAs. It is assumed that one miRNA influences around 1000 proteins, yielding over 30% of protein-coding genes which are targeted by miRNAs as a whole. As such, miRNAs influence nearly every cellular process. Using miRNA profiles of different cancer entities, it could be shown that miRNAs are regulated in cancer and act as oncogenes and tumour suppressors. To discover the impact of miRNAs, it is necessary to know their regulated proteins. Different approaches have been used to identify target proteins of miRNAs. Bioinformatic prediction algorithms successfully detect miRNA targets, but possess a high percentage of false positive and false negative results. Experimentally, the use of mRNA microarray analysis to identify miRNA target genes discovers only the targets which are regulated at the mRNA level. In the submitted thesis, miRNA targets should be identified at the protein level. Therefore, two different quantitative proteomic techniques were used. 2D DIGE (two dimensional difference in-gel electrophoresis) is a gel-based and SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture) is a gel-free, mass spectrometric quantification technique. Using SILAC, proteins of two distinct cell clones or states could be quantified by stable isotope labelling. The in-vivo incorporation of the isotopes during cell cultivation is done by the addition of the 12C-labelled (light) or 13C-labelled (heavy) amino acids lysine and arginine. One problem using the SILAC approach is the conversion of arginine-to-proline, which results in an impairment of quantification accuracy. The solution to this problem was the addition of unlabelled proline, with the effect of arginine no longer being converted to proline. The 2D DIGE and SILAC methods could be compared by identifying miR-155 target proteins. Because of the higher proteome coverage and the higher number of identified miR-155 regulated proteins, the SILAC technique evolved as the more applicable method. During the analysis of miR-155 target proteins, the cell line specificity of microRNA targets could be demonstrated. Building upon this data, the miR-15a and miR-16-1 target proteins relevant in mantle cell lymphoma were identified and analysed in the Granta-519 cell line. Cell cycle, apoptosis and DNA damage repair were influenced by miR-15a and miR-16-1 target proteins. These processes are already described for miR-15a and miR-16-1 in other cancer entities and some proteins, like PDCD6IP, are known as miR-15a and miR-16-1 targets. A multitude of new miR-15a and miR-16-1 effectors were identified as being relevant for mantle cell lymphoma, as shown by the previously published regulation of proteins like TCL1A, MKI67, MCM6 and MCM2 in patient samples. In this thesis, for the first time, quantitative proteomics was used to identify microRNA target proteins with relevance in cancer under the consideration of the cell line specificity of microRNAs.