German Title: Integration von HPV16-DNA in Zervixkarzinogenese : Entwicklung einer neuen Strategie für die Bestimmung von HPV16 Integrationsstellen und Analyse der HPV16-induzierenden c-myc Insertionsmutagenese

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Abstract

Persistent infection with high-risk human papillomavirus (HPV) types, most frequently HPV16, is a necessary cause of cervical cancer. Correlated with tumor progression, the circular HPV DNA usually becomes integrated into the host cell genome with diverse target sites. HPV DNA integration may induce alterations of flanking cellular genes by insertional mutagenesis that contribute to the multistep process of carcinogenesis. The primary goal of this study was the design of a novel strategy to determine HPV16 DNA integration sites at the sequence level in selected pre-cancerous and cancerous lesions obtained from cervical scrapes. While testing restriction-site PCR for HPV16 DNA integration analysis, cell line MRI-H186 was identified as an interesting case of HPV16-induced insertional mutagenesis of the c-myc proto-oncogene. Associated with HPV16 DNA integration into the c-myc locus, over-expression of c-myc was found at both mRNA and protein levels. In addition, several HPV16 integration variants were characterized at the sequence level. One of these variants is strongly expressed as myc-HPV16 hybrid transcript and MycHPV16E2 fusion protein both unique for MRI-H186. In MycHPV16E2, the amino-terminal part of the c-MYC trans-activation domain is fused to the linker and DNA-binding domain of HPV16 E2. These data strengthen the assumption that insertional mutagenesis, in this case c-myc activation/mutation, contributes to cervical carcinogenesis. For HPV16 DNA integration analysis in clinical samples from which genomic DNA is available only in nanogramme amounts and often degraded, a novel strategy enabling the simultaneous sequencing of multiple DNA samples was developed and examined in the present study. This strategy was named ASP16 because it combines whole genome amplification (A), HPV16 DNA selection (S) and high-throughput pyrosequencing (P) followed by bioinformatics data analysis. Two ASP16 experiments were performed, which have proven the feasibility of the novel strategy. The known 3’ viral-cellular junction sequence of integrated HPV16 DNA in MRI-H186 was identified in both experiments. HPV16 DNA integration sites were determined in clinical samples harbouring high percentages of integrated HPV16 DNA. Cancer-related cellular genes near or at the integration sites, namely Gli1 and Grem2, hold great potentials as candidates for HPV16-induced insertional mutagenesis. Future optimizations of the ASP16 method will focus primarily on increasing the average sequence length for a complete coverage of all possible viral DNA breakpoints in the HPV16 E1/E2 region. Taken together, the ASP16 strategy offers for the first time the opportunity to systematically explore HPV16 DNA integration sites in a multiplex manner in clinical samples obtained from cervical scrapes, with particular respect to low quantity and poor quality of the template DNA. This unique feature is of great interest for the incorporation of HPV16 DNA integration analysis into routine cervical screening programs. Application of APS16 will contribute unequivocally to identify lesions of progressive or highly advanced disease and to obtain further insights into the underlying molecular mechanisms of cervical carcinogenesis.

Translation of abstract (German)

Persistierende Infektionen mit einem humanen Papillomvirus (HPV) der Hochrisiko-Gruppe, meistens mit HPV16, bilden die notwendige Voraussetzung zur Entstehung von Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom). Bei der Tumorprogression kommt es häufig zur Integration der HPV-DNA in das Genom der Wirtszellen an unterschiedlichen Zielorten. Die Integration von HPV-DNA kann durch Insertionsmutagenese zur Veränderung flankierender zellulärer Gene führen und auch auf diese Weise zum Mehrstufenprozess der Karzinogenese beitragen. Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer neuen effizienten Strategie, die es ermöglicht, HPV16-DNA-Integrationsstellen in ausgewählten Proben von präkanzerösen und kanzerösen Zervixabstrichen auf Sequenzebene zu bestimmen. Bei Verwendung von Restriktionsstellen-PCR zur HPV16-DNA-Integrationsanalyse stellte sich die Zervixkarzinom-Zelllinie MRI-H186 als ein sehr interessanter Fall für HPV16-induzierte Insertionsmutagenese des c-myc Proto-Onkogens heraus. Deshalb wurden im Rahmen der Arbeit detaillierte Untersuchungen durchgeführt. Assoziiert mit der HPV16-DNA-Integration im c-myc-Locus wurde eine Überexpression von c-myc auf mRNA- und Proteinebene festgestellt. Verschiedene Varianten integrierter HPV16-DNA wurden auf Sequenzebene charakterisiert. Eine dieser Varianten zeigte eine starke Expression als myc-HPV16 Hybridtranskript sowie als MycHPV16E2 Fusionsprotein. Beide myc-HPV16-Hybridmoleküle sind ein besonderes Charakteristikum von MRI-H186. Im MycHPV16E2-Fusionsprotein ist der aminoterminale Teil der MYC-Transaktivierungsdomäne mit der Linker- und DNA-Bindungsdomäne des HPV16 E2-Proteins fusioniert. Die Ergebnisse für MRI-H186 verstärken die Vermutung, dass Insertionsmutagenese, in diesem Fall die Aktivierung/Mutation von c-myc, bei der Zervixkarzinom-Entstehung eine Rolle spielen kann. Für die HPV16-DNA-Integrationsanalyse in klinischen Proben, von denen genomische DNA nur in Nanogramm-Mengen und häufig degradiert zur Verfügung steht, wurde eine neue Strategie entwickelt und ausgetestet, die die gleichzeitige Sequenzierung vieler DNA-Proben ermöglicht. Die Strategie erhielt die Bezeichnung ASP16, da sie Gesamtgenom-Amplifikation (A), HPV16-DNA-Selektion (S) und Hochdurchsatz-Pyrosequenzierung (P) gefolgt von bioinformatischer Datenanalyse miteinander kombiniert. Zwei ASP16-Experimente wurden durchgeführt, mit denen die Ausführbarkeit der neuen Strategie bewiesen werden konnte. Die bekannte 3’ viral-zelluläre Verbindungsstelle der integrierten HPV16-DNA in MRI-H186 konnte in beiden Experimenten nachgewiesen werden. HPV16-DNA-Integrationsstellen wurden in solchen klinischen Proben identifiziert, die einen hohen Anteil an integrierter HPV16 DNA enthielten. Krebsbezogene zelluläre Gene an den Integrationsstellen, besonders Gli1 und Grem2, sind interessante Kandidaten für eine HPV16-induzierte Insertionsmutagenese. Zukünftige Optimierungen der ASP16-Methode sollten hauptsächlich eine Erhöhung der durchschnittlichen Sequenzlängen zum Ziel haben, damit alle möglichen viralen DNA-Bruchpunkte in der HPV16 E1/E2-Region vollständig erfasst werden können. Die ASP16-Strategie bietet erstmalig die Möglichkeit, in klinischen Proben von Zervixabstrichen die HPV16-DNA-Integrationsstellen in einem Multiplex-Ansatz systematisch zu bestimmen, unter besonderer Berücksichtigung der geringen Menge und Qualität der Proben-DNA. Dieses besondere Merkmal der ASP16-Strategie wird eine Eingliederung der HPV16-DNA-Integrationsanalyse in Zervix-Screeningprogramme ermöglichen. Die Verwendung der ASP16-Methode wird dazu beitragen, progressive und hochgradig veränderte Zervix-Läsionen eindeutig zu identifizieren sowie weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen der Zervixkarzinom-Entstehung zu erhalten.