German Title: In situ Untersuchung von biologisch relevanten Molekülen mit Summenfrequenzerzeugungs-Spektroskopie

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Abstract

The molecular-level understanding of biological molecules on solid surfaces is critical in areas including medicine, biologically-based industry, and the development of biotechnologies. In order to gain further knowledge of the orientation and organization of biological molecules adsorbed on surfaces, we used the label-free, interface-specific technique of sum-frequency generation (SFG) spectroscopy. This technique has the distinct advantage of being able to be operated in situ as well as ex situ, allowing for direct comparison of changes in biological molecules between these two states. Films of surface-bound single-stranded DNA (ssDNA) on gold were chosen as model biological systems due to their numerous applications in genetic profiling, nano-assembly, and bio-computing, as well as their relative simplicity as biomolecular layers. Sensitivity and proof-of-principle tests on simple surface-bound, short alkane chains demonstrated the ability of SFG spectroscopy to detect molecular concentrations low enough to be useful in the investigation of biological molecules and to accurately detect the interactions of water with model hydrophobic and hydrophilic self-assembled monolayers. Investigations of multilayers of thymine, adenine, and cytosine nucleobases alone revealed a high degree of order in the thymine layers, with the signals from the methyl group unique to this base clearly visible. Films of both thiolated and non-thiolated surface-bound DNA in air showed little and moderate orientation, respectively, with the methylene stretches of the sugar-phosphate backbone dominating the spectra. Comparison of the changes in signal intensity among thymine, adenine, and cytosine ssDNA films in air and in H2O revealed differences in their solubility, which agreed with current ex situ knowledge of the manner in which these differing DNA types adsorb on gold surfaces. These experiments also revealed the appearance of nucleobase-specific spectra upon exposure to water, which was tied to the higher mobility of the sugar-phosphate backbone under these conditions. Investigations of hybridized ssDNA films in air using SFG spectroscopy indicated that the hybridization process in surface-bound DNA molecules does not necessarily correspond with an increase in molecular order, as is known to happen with DNA molecules in solution, and furthermore that even gentle processing of such hybridized samples for ex situ analysis can significantly disrupt the hybrid structure. These results were confirmed using near-edge absorbtion fine structure spectroscopy. Finally, the results obtained from the model DNA films were applied to a more complex biomolecule, fibronectin, on gold surfaces. Experiments showed that SFG spectroscopy could detect a fibronectin film even under a layer of fixed cells. Further tests on living cells over alkanethiol self-assembled monolayers confirmed this observation. These results give new information on the orientation and organization of DNA films on solid surfaces both in and ex situ, and show how this knowledge can be applied to more complex biological systems. Furthermore, this work contributes to a knowledge base for the application of SFG spectroscopy to future questions in which the label-free, in situ knowledge of surface-bound biological molecules is of critical importance.

Translation of abstract (German)

Das Verständnis von Biomolekülen auf dem molekularen Niveau auf Oberflächen ist insbesondere in der Medizin, der biologischen Industrie und bei der Entwicklung von Biotechnologien essentiell. Die markerfreie und grenzflächenspezifische Summenfrequenzgeneration (SFG) Spektroskopie wurde angewandt um Orientierung und Konformation von Biomolekülen auf Oberflächen zu bestimmen. Diese Methode kann sowohl in situ als auch ex situ verwendet werden. Veränderungen der Biomoleküle zwischen beiden Zuständen werden sichtbar. Auf Gold gebunden Einzelstrang DNA (single-stranded DNA: ssDNA) wurde aufgrund der zahlreiche Anwendungen bei genetischem profiling, Biocomputing und in der Nanotechnologie als biologisches Modellsystem gewählt. Anhand von Messungen an selbstorganisierten Monoschichten, bestehend aus einem unterschiedlichen Verhältnis von deuterierten und undeuterierten Alkanthiolen auf Goldoberflächen, konnte gezeigt werden, dass bei der SFG Spektroskopie geringe Oberflächendichten, wie sie bei der Untersuchung von Biomolekülen vorkommen, ein hinreichendes Signal-Rausch-Verhältnis ergeben. Gleichermaßen wurden die Wechselwirkungen von Wasser mit hydrophoben und hydrophilen selbstaggregierenden Monolagen bestimmt. Messungen an Multilagen von Thymin, Adenin und Cytosin Basen ergeben einen hochgeordneten Zustand der Thyminschicht, der sich von einem starken Signal der basespecifischen Methylgruppe ableitet. Immobilizierung der ssDNA mittles Thiollinken resultierte in einem höhrer Ordgung im Vergleich zu nichttiolierten DNA, dabei dominierten die Methylenstreckschwingungen des Zuckers das Spektrum. Vergleich der Veränderungen des Signals von Thymin, Adenin und Cytosin ssDNA in Luft und Wasser legten Unterschiede in ihrer Löslichkeit dar, welche mit dem aus der Literatur bekannten ex situ Adsorbtionsverhalten der verschiedenen Nukleobasen auf Goldoberflächen korrelieren. Darüber hinaus zeigten die Spektren in wässriger Lösung nukleobasenspezifische Banden, welche sich durch eine erhöhte Mobilität des Zuckerrückgrats erklären lassen. SFG Spektren von hybridisierten ssDNA Filmen in Luft deuten an, dass der Hybridisierungsprozess von oberflächengebundenen ssDNA Molekülen nicht notwendigerweise mit einem Anstieg der molekularen Ordnung korreliert. Dieser Zusammenhang ist anders als es für DNA in Lösung bekannt ist. Ebenso kann selbst bei vorsichtigem Umgang von derartig Proben für die ex situ Untersuchung eine signifikante Störung in der hybridisierten Struktur entstehen. Diese Ergebnisse wurden mit Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie (NEXAFS) bestätigt. Schließlich wurden die zuvor gewonnen Ergebnisse aus den DNA Studien auf das komplexere Biomolekül Fibronection angewandt. Die Experimente zeigten, dass SFG Spektroskopie die Fibronektionfilme selbst durch eine Schicht von fixierten Zellen hindurch detektieren kann. All diese neuen Erkenntnisse über die Orientierung und Organisation von DNA Filmen auf festen Oberflächen bilden die Grundlage für die weiterführende Anwendung der SFG Spektroskopie, bei denen markerfreie und oberflächengebundene Biomoleküle von großer Bedeutung sind.