German Title: Visualisierung und Charakterisierung von HBV-Rezeptor Interaktionen

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Abstract

The human hepatitis B virus (HBV) is characterized by a pronounced liver tropism and a restricted host range. While the viral determinants essential for the host cell entry are well characterized, little is known about cellular factors involved in early steps of HBV infection. Proteoglycans have been described as primary attachment factors, but neither a receptor molecule nor the exact entry pathway is elucidated yet. Peptides comprising the first 47 amino acids (HBVpreS/2-48myr) of the preS1-domain of the HBV surface protein L have been shown to inhibit an infection in vitro and in vivo with high specificity. The full inhibitory potential of HBVpreS/2-48myr relies on the integrity of an essential region (amino acids 9 - 15) and the presence of an acylation. This correlates with viral requirements for infectivity: mutations in the essential region (amino acids 11, 12 and 13) or the removal of the myristoylation render HBV particles non-infectious. It therefore is assumed that HBVpreS/2-48myr and the virus address a common factor on the hepatocyte. This work aimed to visualize and characterize the interaction with this factor. Fluorescence microscopy and flow cytometry showed that fluorescently labeled peptides (HBVpreS/2-48myr-K-FITC) bind to the plasma membrane of differentiated hepatocytes in a sequence- and myristoylation-dependent manner. The binding was not restricted to HBV-susceptible cells like primary hepatocytes (PH) from human or tupaia, and HepaRG cells, but was also detected on PH from non-permissive species (mouse, rat, dog and woodchuck). This demonstrated that a binding-competent preS1-receptor is present also in non-susceptible species. The refractoriness of these cells towards HBV infection therefore must be independent from the receptor interaction. HBV infects only differentiated hepatocytes. Correlating to that, de-differentiation of PH was accompanied by a loss of the ability to bind HBVpreS/2-48myr-K-FITC. Vice versa, HepaRG cells gained binding competence during differentiation, demonstrating that the expression of a functional preS1-receptor depends on the differentiation status of a cell. Sustaining this assumption, hepatoma cell lines like HepG2 and HuH7 did neither bind HBVpreS/2-48myr-K-FITC. Their non-permissiveness therefore can inter alia be explained by a lack of a functional receptor. To determine the affinity of the peptide-receptor interaction, binding curves for HBVpreS/2-48myr-K-FITC-binding to the cell surface of PH were calculated with data from flow cytometry and mass spectrometry. This revealed a bimodal mechanism, consisting of (i) a sequence- and myristoylation-dependent binding to a receptor with a high affinity (KD ~ 60 nM), and (ii) a non-specific, low-affinity-interaction (KD > 2000 nM), that depended only on the myristoylation. Analysis of the binding kinetics on PH showed that equilibrium of the high-affinity interaction was established after 10 minutes. Thereby, the peptide-receptor complexes exhibited an extraordinary high stability over time (t1/2 ~ 11 hours), which indicated a low metabolic turn-over rate. These complexes were tightly associated with the actin cytoskeleton, as they did not show lateral movement within the membrane after photobleaching and co-localized with actin. In order to extend these findings and to investigate the interaction of HBV particles with cells, fluorescently labeled HBV-Alexa488 was produced and characterized on a single-particle level. Chemical labeling of cell-culture derived virus yielded infectious particles of a high purity and bright fluorescence. Detection of HBV-Alexa488 on HepaRG cells showed a binding behavior similar to that of unlabeled HBV. Binding could be enhanced with PEG and inhibited by heparin. The labeled virus produced here can be applied for future single-virus tracing experiments.

Translation of abstract (German)

Das humane Hepatitis B Virus (HBV) zeichnet sich durch einen ausgeprägten Leber- und Wirtstropismus aus. Während die Bedingungen für die Infektiosität eines HBV Partikels gut untersucht sind, ist aufseiten der Wirtszelle nur wenig über die frühen Schritte der Infektion bekannt. Außer Proteoglykanen, die als primäre Bindungsfaktoren dienen, sind bisher keine zellulären Rezeptormoleküle identifiziert worden. Peptide, die aus den N-terminalen 47 Aminosäuren (AS) der präS1-Region des HBV-Oberflächenproteins L bestehen (HBVpräS/2-48myr), können eine Infektion in vitro und in vivo spezifisch inhibieren. Dabei sind eine Sequenz in der sog. essentiellen Region (AS 9 - 15), sowie eine Acylierung am N-Terminus Voraussetzung für die inhibitorische Aktivität dieses Peptids. Parallel hängt auch die Infektiosität eines HBV Partikels von diesen Faktoren ab: Rekombinante Viren, die Mutationen in der essentiellen Region tragen oder denen die Myristoylierung des L-Proteins fehlt, sind nicht infektiös. Aufgrund dieser Korrelation wird angenommen, dass HBVpräS/2-48myr und das Virus einen gemeinsamen Faktor auf der Hepatozyte adressieren. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Faktor zu visualisieren und dessen Bindung zu charakterisieren. Mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (FACS) konnte gezeigt werden, dass fluoreszenz-markierte Peptide (HBVpräS/2-48myr-K-FITC) an die Plasmamembran von differenzierten Hepatozyten binden. Diese Bindung war von der Peptidsequenz und der Myristoylierung abhängig, aber nicht von der Suszeptibilität der Zielzelle. So wurde neben HBV-infizierbaren primären Hepatozyten von Mensch/ Tupaia und HepaRG Zellen auch eine Bindung an Hepatozyten von nicht-infizierbaren Spezies (Maus, Ratte, Hund und Waldmurmeltier) gezeigt. Die Beständigkeit dieser Zellen gegenüber einer HBV Infektion kann also nicht durch das Fehlen eines präS1-Rezeptors erklärt werden. Da HBV ausschließlich differenzierte Hepatozyten infizieren kann wurde untersucht, ob es einen Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad und der präS1-Rezeptor Expression einer Zelle gibt. Es wurde gezeigt, dass Hepatozyten im Laufe der Dedifferenzierung ihre Bindefähigkeit für HBVpräS/2-48myr-K-FITC verlieren. Im umgekehrten Fall erlangen HepaRG Zellen diese Fähigkeit erst mit Erreichen eines differenzierten Zustandes. Auch Hepatoma Zelllinien, wie z.B. HepG2 oder HuH7 Zellen, zeigten keine Bindung von HBVpräS/2-48myr-K-FITC. Die Expression eines funktionalen Rezeptors hängt also vom Differenzierungszustand einer Zelle ab. Um die Affinität der Rezeptorbindung zu bestimmen, wurden mittels FACS und Massenspektrometrie Bindungskurven für die Interaktion von HBVpräS/2-48myr-K-FITC mit der Plasmamembran von PH erstellt. Diese zeigten einen bimodalen Bindemechanismus, bestehend aus (i) einer Sequenz- und Myristoylierungs-abhängigen Interaktion mit einem hoch-affinen Rezeptor (KD ~ 60 nM), und (ii) einer unspezifischen, nur Myristoylierungs-abhängigen Bindung von geringerer Affinität (KD > 2000 nM). Untersuchungen zur Bindungskinetik zeigten, dass ein Reaktionsgleichgewicht bereits nach 10 Minuten erreicht ist, und dass die Peptid-Rezeptor Komplexe mit einer langen Halbwertszeit von t1/2 ~ 11 Stunden relativ lange auf der Zelloberfläche verbleiben. Dies spricht für eine langsame Metabolisierung. Wie Analysen zur lateralen Mobilität und Co-Lokalisations-Experimente ergaben, zeigten die Peptid-Rezeptor-Komplexe dabei eine Interaktion mit dem Aktin- Zytoskelett. Um auch das Bindeverhalten von HBV-Partikeln untersuchen zu können, wurden durch chemische Kopplung von Alexa-Fluor488 Fluoreszenz-markierte, infektiöse HBV-Partikel hergestellt (HBV-Alexa488). Diese zeigten ein Bindeverhalten auf HepaRG Zellen, ähnlich dem von nicht-markiertem HBV, und eignen sich für eine zukünftige Verwendung zur Untersuchung der Virusbindung und Virusaufnahme in Echtzeit.