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type: doctoralThesis
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creators_name: Hillertz, Per
title: Advances in Fragment-Based Drug Discovery : studies of cAMP-dependent protein-kinase A using X-ray-crystallography, surface-plasmon-resonance and high compound concentration assays
title_de: Fortschritte in Fragment-basierte Medikamententwicklung
ispublished: pub
subjects: 570
divisions: 721000
adv_faculty: af-14
keywords: Fragment Based Drug Discovery , Surface plasmon resonance , Protein crystallography , Pre-clinical drug discovery
abstract: Development of a new, or candidate, therapeutic drug is a challenging process that must ensure that favorable target selectivity, potency, pharmacokinetics, and pharmacodynamics, as well as lack of toxicity, all fall within the therapeutic window. During the hit-optimiza­tion stage, the focus shifts toward optimizing potency and target selectivity. Fragment-based methods have recently been developed to the point where they represent a promising strategy in drug discov­ery, where a variety of biophysical techniques may be employed for fragment library screen­ing and characterizing hit-fragments. Hit-fragments deduced from fragment-based screenings typically have ligand efficiencies (LE) exceeding those of average HTS‑hits. Structure data on the complexes formed by fragment-target-protein structures yield a much-better starting point for hit optimization and lead discovery. This dissertation presents two fragment-screening studies. Under the first, surface-plasmon-resonance (SPR) analyses and biochemical assays at high compound concentrations (HCA) were employed in primary screenings of protein-kinase A (PKA) that were followed by X-ray crystallographic determinations of the structures of the PKA‑frag­ments involved. The aim of that study was testing the characteristics, outcomes, and limits of both SPR and HCA as fragment-screening methods, as well as estimating hit rates that could be confirmed by X‑ray crystallographic analyses. Under the second, in-house, biochemi­cal-assay data were used for selecting the fragment-like inhibitors of PKA to be subjected to X‑ray crystallo­graphic structure determina­tions. The biochemical-assay data involved were taken from screening cam­paigns, such as high-through­put screenings (HTS), or other, available, in-house, biochemi­cal-assay runs. The goal there was estimating the extent to which existing HTS‑data might be util­ized for obtaining three-dimensional, fragment-target, protein structure data, without need for conducting any additional fragment-screening runs. Following screening a library of 257 fragment-like compounds using SPR and HCA, a total of 26 hit-fragments were chosen for X-ray structure determinations, which yielded the structures of nine frag­ment-PKA-struc­tures. Under the second approach, 67 fragments exhibiting > 50 % inhibi­tions taken from the avail­able, in-house, biochemical-assay data were selected for structure deter­min­a­tions, which yielded the structures of 21 fragment-PKA-complexes. Both approaches yielded respectable hit rates and descriptions of the characteristics of numerous fragment-pro­tein interactions. The structural information and data on fragment-target-protein complexes gained from those two setups might well accelerate the drug-discovery process throughout the pharmaceutical industry.
abstract_translated_text: Die Entwicklung eines neuen therapeutischen Arzneimittels ist ein umfassender Prozess. Sie schließt umfangreiche Studien von Wirksamkeit, Selektivität, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Toxizitätsbestimmungen ein. Während der Hit-Optimierungsstufe liegt der Fokus auf der Optimierung von Bindungsaffinität und Selektivität. Als vielversprechende Strategie werden seit kurzem Fragment-basierte Studien als neue Methode im Bereich der Wirkstoffidentifizierung angewendet (Fragment Based Drug Discovery - FBDD). Dabei kommen eine Vielzahl biophysikalischer Technologien für das sogenannte Fragment-Screening und die Charakterisierung von Hit-Fragmenten zum Einsatz. Die im Fragment-Screening gefundenen Hit-Moleküle haben in der Regel eine höhere Ligand-Effizienz (LE) als HTS-hits. Die nachfolgende Aufklärung des Bindungsmodus der Fragment-Hits im Proteintarget durch Röntgenstrukturanalyse ist essentieller Bestandteil des Fragment-Screenings. Die Strukturdaten dieser Fragment-Target-Proteinstrukturen gebildet geben einen viel besseren Ausgangspunkt für die folgende Hit-Optimierung durch rationales Design. Die vorliegende Dissertation präsentiert zwei Fragment-basierte Studien zum Screening von Protein-Kinase A (PKA) Inhibitoren. Zuerst wurden Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface Plasmon Resonance - SPR) Analysen und biochemische Inhibitionsmessungen bei hohen Fragment Konzentrationen (High Concentration Assay - HCA) durchgeführt. Danach erfolgte die Strukturbestimmung der PKA-Fragment Komplexe mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse.  Das Ziel dieser Studie war die Prüfung der Kenndaten, Ergebnisse und Grenzen von SPR und HCA als Fragment-Screening-Methoden, sowie die Bestätigung der Fragment-hits durch Röntgenstrukturanalyse. In der zweiten Studie wurden Daten eines bei Merck etablierten biochemischen Assays für die Fragmentwahl herangezogen und ebenfalls die Struktur dieser Fragment-PKA Komplexe kristallographisch bestimmt. Die biochemischen Inhibitionsdaten werden parallel zu den Screening-Kampagnen, wie z. B. High-Throughput-Screening (HTS) und anderen Merck internen Tests erfasst. Ziel war es, zu klären, in welchem Umfang bestehende HTS-Daten ohne zusätzliches Fragment Screening für den Erhalt von drei-dimensionalen Fragment-Target-Protein-Struktur-Daten genutzt werden können. Es wurde eine Bibliothek von 257 Fragment Molekülen mittels SPR und HCA gescreent. Aus den Ergebnissen wurden insgesamt 26 Hit-Fragmente für X-ray Bestimmungen gewählt, woraus neun Fragment-PKA-Strukturen gelöst werden konnten. Im zweiten Ansatz wurden 67 Fragmente für die Röntgenstrukturanalyse ausgewählt, die in den biochemischen Inhibitionsmessungen eine mehr als 50%ige Hemmungen der PKA Substrat-Phosphorylierung zeigten. Aus diesem Ansatz  ergaben sich 21 Fragment-PKA-Komplex Strukturen. Beide Ansätze ergaben beachtliche Trefferquoten und interessante Bindungsmodi der Fragment-Protein-Interaktionen. Die in dieser Arbeit identifizierten Fragmente und Proteinstukturen zeigen den Erfolg Fragment-basierter Methoden in der Wirkstoffforschung. 
abstract_translated_lang: ger
date: 2010
date_type: published
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00010665
ppn_swb: 627370624
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-106657
date_accepted: 2010-05-19
advisor: HASH(0x556120c5f798)
language: eng
bibsort: HILLERTZPEADVANCESIN2010
full_text_status: public
citation:   Hillertz, Per  (2010) Advances in Fragment-Based Drug Discovery : studies of cAMP-dependent protein-kinase A using X-ray-crystallography, surface-plasmon-resonance and high compound concentration assays.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/10665/1/BZH_Heidelberg_Dissertation_Per_Hillertz.pdf