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type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Friedrich, Achim
title: Entwicklung hochempfindlicher Protease- und DNA-Nachweisverfahren für den Einsatz in der Krebsforschung und medizinischen Diagnostik
title_en: Development of Highly Sensitive Protease and DNA Detection Methods for Application in Cancer Research and Clinical Diagnostics
ispublished: pub
subjects: 540
divisions: 850300
divisions: 120300
adv_faculty: af-12
keywords: Charge-Transfer-Farbstoff , stöchiometrisch , Proteinmarkierung , Protease , KrebsSingle-Molecule Spectroscopy , Protein Modification , DNA-Probe , Cancer , Protease
cterms_swd: DNS-Sonde
cterms_swd: Einzelmolekülspektroskopie
cterms_swd: Punktmutation
cterms_swd: Kallikreine
abstract: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung hochempfindlicher Nachweisverfahren für proteolytische Enzyme. Viele Proteasen nehmen Schlüsselfunktionen in den Metastasierungsprozessen ein, dem größten Problem bei der Behandlung von Krebs. Sensitive Nachweismethoden für proteolytische Aktivität tragen zu einem tiefergehenden Verständnis der bei der Entstehung von Tochtergeschwüren beteiligten proteolytischen Prozesse bei und ebnen somit den Weg zur Entwicklung effektiver Antitumormedikamente. Unter Verwendung modifizierter natürlicher Proteine als Proteasesubstrate konnten zwei einzelmolekülspektroskopiebasierte Detektionsmethoden erarbeitet werden, welche einen sensitiven Nachweis proteolytischer Aktivität erlauben. Während sich das eine Verfahren der Detektion zeitlich korrelierter Fluoreszenzsignale bedient, nutzt das andere funktionalisierte Oberflächen zur Erkennung der Proteaseaktivität. Um  Proteinsubstrate fluoreszent markieren zu können, musste eine neuartige Methode etabliert werden, welche die stöchiometrische Modifizierung von Proteinen unter Erhalt ihrer biologischen Funktion ermöglichte. Darüber hinaus gelang die Weiterentwicklung des Smart Probe-basierten Nachweisverfahrens zur sensitiven und spezifischen Diskriminierung von DNA-Punktmutationen durch den Einsatz von Oligonukleotiden, die zur Sonde bei der Anbindung an die Wildtypsequenzen in Konkurrenz stehen.  Auf Grundlage der in diesen Arbeiten gesammelten Erfahrungen konnte zusätzlich eine neuartige, auf den speziellen Emissionseigenschaften des Coumarinfarbstoffs Dy-520XL beruhende DNA-Sonde konzipiert werden, welche ebenfalls eine eindeutige und einfache Diskriminierung von Punktmutationen mit hoher Sensitivität erlaubt.  
abstract_translated_text: The aim of this thesis was the development of highly sensitive detection assays for proteolytic enzymes. Many proteases play key roles in metastatic processes, the major challenge for cancer treatment. Sensitive detection methods for proteolytic activity contribute to a more profound understanding of proteolytic processes involved in the development of metastasis and facilitate the development of effective anti-tumor drugs. Using modified natural proteins as protease substrates, two methods based on single-molecule spectroscopy which enable the sensitive detection of proteolytic activity were established. While the first assay deals with the recognition of time-correlated fluorescence signals, the second one uses functionalized surfaces for the fluorescence-based identification of protease activity. A new protein labeling method was established in order to tag substrates fluorescently in a stoichiometric manner while preserving native protein functionality. Furthermore, the Smart Probe-based assay for detecting single nucleotide polymorphisms was successfully enhanced in this work, using oligonucleotides that compete with the Smart Probe in binding to target sequences which contain mismatches. This modification enables the specific and sensitive recognition of single nucleotide polymorphisms. Based on the findings of the presented work, a novel DNA-Probe was designed using the special properties of the Coumarin dye Dy-520XL, allowing a specific and simple discrimination of single nucleotide polymorphisms with high sensitivity. 
abstract_translated_lang: eng
class_scheme: pacs
class_labels: 82.50.Hp, 82.39.Pj, 82.37.Vb, 87.19.xj, 87.18.Xr
date: 2010
date_type: published
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id_number: 10.11588/heidok.00010682
ppn_swb: 627742084
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-106827
date_accepted: 2010-04-16
advisor: HASH(0x556120b26880)
language: ger
bibsort: FRIEDRICHAENTWICKLUN2010
full_text_status: public
citation:   Friedrich, Achim  (2010) Entwicklung hochempfindlicher Protease- und DNA-Nachweisverfahren für den Einsatz in der Krebsforschung und medizinischen Diagnostik.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/10682/1/Dissertation_AFriedrich.pdf