TY  - GEN
TI  - Pharmakokinetische Untersuchungen genkorrigierter Hämatopoese in klinischen retroviralen Studien
Y1  - 2010///
AV  - public
ID  - heidok11189
KW  - Immunerkrankungenimmunodeficiencies
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11189/
A1  - Paruzynski, Anna
N2  - Die somatische Gentherapie mit retroviralen Vektoren konnte erfolgreich zur Behandlung monogenetischer Erbkrankheiten eingesetzt werden. Jedoch traten bereits in 3 klinischen Gentherapiestudien schwerwiegende vektorinduzierte Nebenwirkungen auf. Integrationsstellen (IS)-Analysen erlaubten die Detektion von Integrationen in oder in der Nähe von Protoonkogenen, die zu einer Überexpression der Gene und zur malignen Entartung der betroffenen Zellen führten, an deren Folgen 2 der 7 erkrankten Patienten verstarben. Umfassende Analysen der Vektor-IS und deren Einfluss auf zelluläre biologische Prozesse sind daher von größter Wichtigkeit und können dabei helfen, mögliche Risiken schon frühzeitig auf der molekularen Ebene zu erkennen.  Die Bestimmung der IS erfolgte in den untersuchten klinischen Gentherapiestudien mithilfe der linearen amplifikationsmediierten PCR (LAM-PCR). Zur Verbesserung des zugänglichen Anteils der IS wurde ein mathematisches Modell entwickelt, das die genomische Zugänglichkeit von IS in Abhängigkeit der verwendeten Restriktionsenzyme a priori berechnet. Weiterer Bestandteil meiner Arbeit war die Etablierung einer nicht restriktiven (nr) LAM-PCR, die eine IS-Analyse ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen ermöglicht.  Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende IS-Analyse in Kombination mit der Sanger Sequenzierung von 5 klinischen (2547 IS) und 3 präklinischen (1316 IS) gammaretroviralen Studien zeigte beeindruckende Übereinstimmungen. So wurden über 70% aller IS in genkodierenden Bereichen detektiert mit einer Anhäufung um die Transkriptionsstartstelle (TSS, 23%-39%). Weiterhin konnten wir die Protoonkogene MDS1-EVI1 (108 IS), PRDM16 (37 IS), LMO2 (13 IS), CCND2 (12 IS) und SETBP1 (10 IS) als gemeinsame bevorzugte Integrationsorte beobachten. Ein weiterer Fokus stellten die Klonalitäts- und pharmakokinetischen Analysen der Proben von insgesamt 9 Patienten aus zwei X-CGD, einer ADA-SCID und einer WAS gammaretroviralen Gentherapiestudie dar, die über einen Zeitraum von bis zu 5 Jahren nach Therapie erfolgten. In allen untersuchten Studien zeigte die (nr) LAM-PCR Analyse gefolgt von der Pyrosequenzierung (GS FLX, > 20000 IS) ebenfalls eine nicht zufällige Verteilung mit einer bevorzugten Integration in genkodierenden Bereichen (47%-72%) und einer Anhäufung der IS um die TSS (8%-16%). Weiterhin wurden ebenfalls bevorzugte Integrationsorte in oder in der Nähe der Protoonkogene MDS1-EVI1 (289 IS), PRDM16 (104 IS), LMO2 (52 IS), SETBP1 (34 IS) und CCND2 (33 IS) detektiert. Mittels LAM-PCR ?Sequence Count? Analysen konnte eine vektorinduzierte in vivo Selektion einzelner MDS1-Klone in 3 der insgesamt 4 X-CGD Patienten beobachtet werden. Reverse Transkriptase (RT)-PCR Untersuchungen zur Genexpression in einem X-CGD Patienten zeigten eine Überexpression der von der Integration betroffenen Gene MDS1-EVI1 und STAT3. In den weiteren Patienten der untersuchten Gentherapiestudien verlief die hämatopoetische Repopulation bis zum letzten analysierten Zeitpunkt polyklonal. Allerdings konnten wir auch in der WAS Gentherapiestudie eine in vivo Selektion eines CCND2- und eines MDS1-Klons über ?Sequence Count? Analyse und qPCR nachweisen.  Die Klonalitätsanalysen mittels LAM-PCR/nrLAM-PCR und Hochdurchsatzsequenzierung (Pyrosequenzierung, GS FLX) führten zu einer einzigartigen Datensammlung von insgesamt > 20000 IS aus klinischem Patientenmaterial. Unsere Untersuchungen zeigten, dass herkömmliche retrovirale Vektoren mit aktivem LTR einen sehr signifikanten Einfluss auf die zelluläre Genexpression ausüben. Es bleibt längerfristigen Untersuchungen vorbehalten, zu klären, welche biologischen Auswirkungen die retro- und lentiviralen Vektorsysteme mit selbstinaktivierendem (SIN) LTR auf das Schicksal der transduzierten Zelle haben. 
ER  -