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status_changed: 2012-08-15 08:57:07
type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Haag, Mathias
title: Development of Mass Spectrometric Methods for the Quantification of Membrane Lipids : Studies on Mitochondria, T Cells, Golgi Membranes and COPI Vesicles
title_de: Entwicklung massenspektrometrischer Methoden für die Analyse von Membranlipiden : Untersuchungen an Mitochondrien, T-Zellen, Golgi-Membranen und COPI Vesikeln
ispublished: pub
subjects: ddc-570
divisions: i-711000
adv_faculty: af-14
keywords: Lipids , Lipidomics , Quantification , Mass Spectrometry , Nano-ESI MS/MS
abstract: Biological membranes contain more than thousand different lipid classes and lipid species that are far from being fully characterized. In order to understand molecular processes that are connected to membrane lipids a continuous development of analytical methods is required. In this thesis, nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry (nano-ESI-MS/MS) was employed to establish methods for the quantification of cardiolipin (CL), diacylglycerol (DAG) and the phosphoinositides PIP and PIP2. The methods were applied for the analysis of mitochondria, Golgi membranes and T cells in order to address scientific questions: I. The quantitative analysis of CL in mitochondria, isolated from yeast mutants, showed that GEP genes (genetic interactors of prohibitins) are involved in the regulation of mitochondrial phospholipids CL and phosphatidylethanolamine. Strikingly, the mass spectrometric identification of the lipid intermediate phosphatidylglycerolphosphate (PGP) in mitochondria from delta gep4 mutants supported the identification of Gep4 as a novel PGP phosphatase required for CL biosynthesis. II. The quantitative analysis of DAG revealed that ilimaquinone (IQ)-induced vesiculation of the Golgi complex significantly affects the level of DAG. This result is consistent with previous observations that lipid-modifying enzymes, such as phospholipase D and PA phosphatase, are activated and suggests that membrane lipids play a critical role during the process of IQ-mediated Golgi vesiculation. III. The quantitative analysis of PIP, PIP2 and DAG in conventional T cells showed that T cell receptor (TCR)-induced stimulation significantly affects the level of signaling lipids. This result was an important readout to address the question whether regulatory T cells interfere with proximal lipid signaling events in conventional T cells. Furthermore, a lipidome analysis of Golgi membranes and COPI vesicles was performed. The generated data confirmed previous findings that sphingomyelin and cholesterol are segregated during the formation of COPI vesicles. Moreover, the lipid analysis revealed that COPI vesicles display a lipid composition similar to the endoplasmatic reticulum, with elevated levels of phosphatidylcholine and phosphatidylinositol. The characteristic lipid composition supports the scenario that COPI vesicle formation occurs at liquid-disordered domains in the Golgi complex.
abstract_translated_text: Biologische Membranen bestehen aus mehr als tausend verschiedenen Lipidklassen und Lipidspezies, welche bisher nur unvollständig charakterisiert sind. Mit dem Ziel molekulare Prozesse, an denen Membranlipide beteiligt sind, zu verstehen, bedarf es einer kontinuierlichen Weiterentwicklung analytischer Methoden. In dieser Arbeit wurde Nano- Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (Nano-ESI-MS/MS) verwendet, um Methoden für die Quantifizierung von Cardiolipin (CL), Diacylglycerol (DAG) und den Phosphoinositiden PIP und PIP2 zu etablieren. Mit dem Ziel wissenschaftliche Fragestellungen zu adressieren, wurden die Methoden für die Analyse von Mitochondrien, Golgi-Membranen und T-Zellen angewendet: I. Die Quantifizierung von CL in Mitochondrien, welche aus Hefemutanten isoliert wurden, zeigte, dass GEP Gene (Genetische Interaktoren von Prohibitinen) an der Regulation der mitochondrialen Phospholipide CL und Phosphatidylethanolamin beteiligt sind. Weiterhin unterstützte die massenspektrometrische Identifizierung des Lipidintermediates Phosphatidylglycerolphosphat (PGP) in Mitochondrien von Delta gep4 Mutanten die Identifizierung von Gep4 als neuartige PGP-Phosphatase welche für die CL-Biosynthese benötigt wird. II. Die Quantifizierung von DAG zeigte, dass die Ilimaquinone (IQ)-induzierte Vesikulierung des Golgi-Komplexes einen signifikanten Einfluss auf DAG-Level hat. Dieser Effekt bestätigte, dass Lipid-modifizierende Enzyme, wie Phospholipase D und PA-Phosphatase, aktiviert werden und lässt darauf schließen, dass Membranlipide eine entscheidende Rolle während der IQ-vermittelten Golgi- Vesikulierung spielen. III. Die quantitative Analyse von PIP, PIP2 und DAG in konventionellen T-Zellen, zeigte, dass die T-Zell-Rezeptor (TZR)-induzierte Stimulierung einen signifikanten Einfluss auf die Mengen dieser Signallipide hat. Dieses Resultat war von Bedeutung für die weitere Fragestellung, ob regulatorische T-Zellen die proximale Lipid-Signalweiterleitung in konventionellen T-Zellen beeinflussen. Weiterhin wurde eine Lipidome-Analyse von Golgi-Membranen und COPI-Vesikeln durchgeführt. Die erhobenen Daten bestätigten, dass Sphingomyelin und Cholesterin während der COPI-Vesikelbildung segregiert werden. Weiterhin zeigten die Lipidanalysen, dass COPI-Vesikel eine ähnliche Lipidzusammensetzung wie das Endoplasmatische Retikulum aufweisen, mit erhöhtem Gehalt an Phosphatidylcholin und Phosphatidylinositol. Die charakteristische Lipidzusammensetzung lässt darauf schließen, dass die Bildung von COPI-Vesikeln an „liquid-disordered“ Domänen innerhalb des Golgi-Komplexes stattfindet.
abstract_translated_lang: ger
date: 2010
date_type: published
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00011450
ppn_swb: 643958827
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-114501
date_accepted: 2010-12-17
advisor: HASH(0x55de57a8c960)
language: eng
bibsort: HAAGMATHIADEVELOPMEN2010
full_text_status: public
citation:   Haag, Mathias  (2010) Development of Mass Spectrometric Methods for the Quantification of Membrane Lipids : Studies on Mitochondria, T Cells, Golgi Membranes and COPI Vesicles.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11450/1/Mathias_Haag_Dissertation_2010x.pdf