<> "The repository administrator has not yet configured an RDF license."^^ . <> . . "Diagnostik von invasiven Aspergillusinfektionen aus klinischen Materialien durch fluoreszenzspektroskopische und massenspektrometrische Methoden"^^ . "Aspergillus-Spezies sind ubiquitär vorkommende Schimmelpilze. Bei immunsupprimierten Patienten wie Leukämie- und Transplantationspatienten verursachen Aspergillus-Spezies opportunistische Infektionen mit häufig letalem Ausgang. Die Diagnostik dieser Erkrankung beschränkt sich aktuell auf einen Aspergillus-Antigennachweis, molekularbiologische Diagnosemethoden und bildgebende Verfahren. Alle Methoden haben allerdings eine jeweils ungenügende diagnostische Sensitivität und/oder Spezifität. Zudem sind molekularbiologische Nachweismethoden durchgängig sehr aufwändige Verfahren mit noch mangelnder Standardisierung und daher in der Verbreitung auf wenige spezialisierte Laboratorien beschränkt. Ziel des durch die Deutsche José-Carreras-Leukämiestiftung geförderten Projektes war die Entwicklung und Validierung einer neuen, massenspektrometrie-basierten Diagnosestrategie, welche die Früherkennung von invasiven Aspergillus-Infektionen aus Serumproben von Hochrisikopatienten mit verbesserter diagnostischer Sensitivität und Spezifität ermöglichen soll. Der unmittelbare diagnostische Einsatz von massenspektrometrie-basierten Profiling-Untersuchungen ist aufgrund hoher präanalytischer Varianz und großer Abundanzunterschiede in der Proteinzusammensetzung von klinischem Probenmaterial bisher nicht möglich. Durch Reporter-Peptid-Spiking (RPS) können bisherige Limitierungen des MS-basierten Profiling überwunden werden. Grundlage des zu entwickelnden Verfahrens ist die Spaltung von Peptidsubstraten durch krankheitsassoziierte Proteasen in einer klinischen Probe wie etwa Serum. Proteasen spielen bei der Pathogenese vieler Erkrankungen, spezifisch auch bei der Entwicklung einer invasiven Aspergillose, eine entscheidende Rolle. Die sezernierten Proteasen des Aspergillus fumigatus wurden während dieser Arbeit direkt durch massenspektrometrische Proteomanalyse und indirekt durch funktionelle Untersuchungen charakterisiert. Für die direkte Charakterisierung der Proteasen wurde der Kulturüberstand mittels trägerloser Elektrophorese (FFE) getrennt. Anschließend wurde die Proteaseaktivität in den erhaltenen Fraktionen mit fluoreszenzmarkierten Peptiden bestimmt. Die höchste Proteaseaktivität wurde in Fraktionen des sauren pH-Bereiches detektiert. Parallel dazu wurden die Assays mit verschiedenen Proteaseinhibitoren durchgeführt. Die Ergebnisse des Inhibierungsmusters wiesen deutlich darauf hin, dass vorwiegend Metallo- und Serinproteasen die verwendeten Peptide abbauen. Die Fraktionen wurden einem tryptischen Verdau unterzogen und per LC-MS/MS Analyse untersucht. Die Identifizierung der im Kulturüberstand enthaltenen Proteine resultierte in der Detektion von vier Proteasen unter zahlreichen anderen Aspergillus-spezifischen Proteinen und Enzymen. Die systematische Substratsuche begann in silico in Substratbibliotheken wie Merops und Publikationen. Aus einer Vielzahl von synthetisierten Peptidsubstraten konnten fünf Substrate selektiert und für einen Proteaseassay mit massenspektrometrischer Detektion etabliert werden. Diese Substrate wurden spezifisch durch Aspergillus fumigatus abgebaut. Die Peptidfragmente wurden nach der Inkubation seriell mittels Affinitätschromatografie aufgereinigt und mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer gemessen. Der Assay wurde in einer umfangreichen Studie mit Patientenproben angewendet. Dabei wurden Proben von gesicherten Aspergillose-Fällen verwendet, sowie weitere Proben von Hochrisikopatienten. Die Sensitivität bzw. Spezifität des Assays betrug 41-81% bzw. 57-85% und war damit dem konventionellen Galaktomannan-Test in Bezug auf die Sensitivität für die verwendeten Modelle überlegen (27 bzw. 36% Sensitivität). Das Methodenprinzip (\"proof-of-principle\") konnte mit den Messungen bewiesen werden. Dennoch gilt es die Spezifität und Sensitivität zu verbessern, wie z. B. durch den Einsatz von komplexen randomisiertem Peptidbibliotheken oder durch weitere Modifikationen an den Schnittstellen der Peptide. Daraus kann dann ein Reporterpeptidmix aus mehreren Substraten (Multiplex-Ansatz) als Screening genutzt werden. Alternativ zur Massenspektrometrie wurde mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie versucht, ein weiteres Testsystem zur Signaldetektion von Proteaseaktivität zu etablieren. Dazu wurde ein Substrat aus den benutzten fünf massenspektrometrischen Substraten ausgewählt, und für diese Methode modifiziert. Eine Differenzierung durch den Diffusionskoeffizienten war nur bedingt möglich. Durch weitere Optimierung des Reporterpeptidformates und dem Einsatz von Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie sollte es möglich sein, die diagnostische Leistungsfähigkeit des funktionellen Protease Profilings weiter zu verbessern."^^ . "2010" . . . . . . . . . "Madlen"^^ . "Neustadt"^^ . "Madlen Neustadt"^^ . . . . . . "Diagnostik von invasiven Aspergillusinfektionen aus klinischen Materialien durch fluoreszenzspektroskopische und massenspektrometrische Methoden (PDF)"^^ . . . "dissertation_madlen_neustadt.pdf"^^ . . . "Diagnostik von invasiven Aspergillusinfektionen aus klinischen Materialien durch fluoreszenzspektroskopische und massenspektrometrische Methoden (PDF)"^^ . . . "Erratum.pdf"^^ . . . "Diagnostik von invasiven Aspergillusinfektionen aus klinischen Materialien durch fluoreszenzspektroskopische und massenspektrometrische Methoden (Other)"^^ . . . . . . "indexcodes.txt"^^ . . . 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"540 Chemistry and allied sciences"@en . .