%0 Generic
%A Kilian, Elena
%D 2011
%F heidok:11649
%K Pyk2 , Brsk , Mark , AMPKrKPyk2 , Brsk , Mark , AMPKrK
%R 10.11588/heidok.00011649
%T Identifizierung von Mitgliedern der AMPK-verwandten Kinasen als neue Substrate der Tyrosinkinase Pyk2
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11649/
%X Die prolinreiche Tyrosinkinase 2 (Pyk2) beeinflusst eine Vielzahl unterschiedlicher Signaltransduktionswege wie Cytoskelettreorganisation, Zellanheftung und Zellbewegung, Neurotransmission und Neuroplastizität, Apoptose oder die Aktivierung verschiedener MAPK-Kaskaden. Es scheint plausibel, dass Pyk2 mit einer großen Zahl von Proteinpartnern interagiert und dadurch verschiedene „Downstream“-Signalwege steuert. Diese Interaktionspartner können Bindungspartner oder Substrate von Pyk2 sein. Bis heute sind nur wenige direkte Pyk2 Substrate bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin neue Pyk2 Substrate zu identifizieren, um damit einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Koordination einer solchen funktionellen Diversität zu leisten. Um dieses Ziel zu erreichen wurde anhand eines bioinformatorischen Verfahrens, basierend auf bekannten, direkt von Pyk2 phosphorylierten Substraten eine Konsensussequenz entwickelt, mit deren Hilfe durch Datenbankrecherchen putative Substrate identifiziert werden konnten. Diese wurden durch in vitro Kinasereaktionen und Aktivitätsmessungen sowie zelluläre Analysen charakterisiert. Zur präzisen Kartierung der von Pyk2 phosphorylierten Tyrosinreste wurde ein breites Arsenal von Methoden angewandt und mittels MALDI-TOF/TOF-MS konnte schließlich gezeigt werden, dass der bioinformatisch vorhergesagte Tyrosinrest-351 in Brsk1 tatsächlich von Pyk2 phosphoryliert wird. Diese Befunde wurden durch gerichtete Mutagenese und Cotransfektionsstudien in Hek 293T Zellen bestätigt. Während analoge massenspektrometrische Ansätze für Brsk2 versagten, konnte in diesem Fall durch eine Kombination von gerichteter Mutagenese, Coimmunpräzipitation, in vitro Kinasereaktion und 2D-Phosphopetidkartierung Tyrosin-334 als Pyk2 Phosphorylierungsstelle in Brsk2 identifiziert werden. Ein Sequenzvergleich weiterer AMPK-verwandter Kinasen führte zur Entdeckung von vier weiteren potentiellen Pyk2 Substraten, den “MAP/microtubule affinity-regulated kinase” (Mark) Proteinen. Mark1-4 werden durch Pyk2 in vitro phosphoryliert. Neben Brsk1, Brsk2 und den vier Mark Proteinen ergaben in vitro Kinasereaktionen auch, dass Nuak1 und 2 mögliche Substrate von Pyk2 darstellen könnten. Die Aufklärung der Zusammenhänge zwischen Pyk2 und den bisher nur wenig charakterisierten AMPK-verwandten Kinasen stellt eine besondere Herausforderung dar und bietet zugleich die Möglichkeit vielleicht einen ganz neuen, bisher noch nicht identifizierten Signalweg zu beschreiben, der zu einem besseren Verständnis der Kinase Pyk2 selbst sowie ihren Substraten beitragen könnte.