%0 Generic
%A Hahn, Bettina
%D 2011
%F heidok:11771
%K Massenspektrometrie , isotopenmarkierte Standards , Phosphorylierungsgrad , ERKmass spectrometry , isotopically labeled standards , phosphorylation degree , ERK
%R 10.11588/heidok.00011771
%T One-source-Standards zur Bestimmung von positionsspezifischen Proteinphosphorylierungsgraden erlauben genauere Einblicke in die intrazelluläre Signaltransduktion
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/11771/
%X Reversible Proteinphosphorylierung ist ein Schlüsselprinzip der intrazellulären Signaltransduktion. Häufig wird eine Änderung des Phosphorylierungsstatus als relative Änderung zu einem Anfangsstatus angegeben. Hingegen bietet der Phosphorylierungsgrad eine wesentlich informativere Systembeschreibung und eine fundierte Grundlage für Modellrechnungen.  One-source-Peptid-/Phosphopeptidstandards wurden mit dem Ziel entwickelt, Phosphorylierungsgrade von Proteinen positionsspezifisch und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Kernpunkt der Methode ist die Erzeugung einer Mischung eines stabilisotopenmarkierten Peptid-/Phosphopeptid-Standardpaars, dessen stöchiometrisches Verhältnis exakt bekannt ist. Dazu wird eine Lösung des Phosphopeptidstandards in zwei Aliquots geteilt. Ein Aliquot wird mit antarktischer Phosphatase dephosphoryliert, während das andere Aliquot unbehandelt bleibt. Die Phosphatase wird anschließend durch kurzzeitiges Erhitzen irreversibel inaktiviert und aus beiden Lösungen eine volumetrisch definierte Mischung hergestellt. Die Standardpaare wurden den immunpräzipitierten und mittels SDS-Gelelektrophorese gereinigten Zielproteinen auf der Stufe des Verdaus zugegeben und die Analysen mittels nano-Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie durchgeführt. Bei Peptiden mit zwei Phosphorylierungsstellen erlaubte die Einführung mehrerer Isotopenmarkierungen eine individuelle Quantifizierung aller vier möglichen Formen. Zunächst wurde die Methode anhand der Parameter Wiederfindung, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit erfolgreich validiert. Der relative Fehler bei der Analyse technischer Replikate betrug durchschnittlich weniger als 10 %, bei biologischen Replikaten hingegen 29 %. Der lineare Messbereich umfasste etwa zwei Größenordnungen, und die untere Bestimmungsgrenze für Phosphopeptide lag bei 10-20 fmol. Die Methode wurde auf die Phosphorylierungsgradbestimmung der Signalproteine STAT6, Akt1, ERK1 und ERK2 in verschiedenen Zellsystemen angewandt.  Im Vordergrund stand die Analyse der dualen ERK1/2-Phosphorylierung durch die MAPK-Kinase MEK. Die ERK-Signalkaskade spielt eine zentrale Rolle in der Antwort von Zellen auf extrazelluläre Stimuli wie Wachstumsfaktoren und Zytokine. Dennoch sind die Mechanismen der dynamischen ERK-Aktivierung und –Deaktivierung in vivo nicht vollständig verstanden. Mit Hilfe von one-source-Standards wurden HGF- und IL6-induzierte ERK1/2-Phosphorylierungskinetiken in primären Maushepatozyten und der Tumor-Keratinozytenzelllinie HaCaT A5 analysiert. Es wurden zwei mathematische Modelle erstellt, die die quantitativen Daten basierend auf einem prozessiven oder distributiven ERK-Aktivierungsmechanismus beschreiben. Wie die experimentelle Validierung ergab, war nur das distributive Modell in der Lage, erfolgreich die Zeitspanne bis zur vollständigen Dephosphorylierung des totalen ERK1/2-Pools in Hepatozyten bei Hemmung der MEK-Aktivität vorauszusagen. Somit wurde erstmals ein zweistufiger, distributiver ERK-Phosphorylierungsmechanismus in primären Maushepatozyten nachgewiesen. 
%Z Teile in: Proteomics