TY  - GEN
AV  - public
ID  - heidok12953
Y1  - 2011///
KW  - Riboswitch 
KW  -  Transcriptome 
KW  -  Photoaffinity Crosslinking
TI  - Affinitätsbasierte chemische Transkriptomanalyse
N2  - Die Entdeckung von RNA-Sequenzen, die in der Lage sind, die Konzentration eines Metaboliten zu messen und abhängig davon die Genexpression zu regulieren hat Metaboliten-bindende RNAs in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses gerückt. Bisher existiert jedoch ein Mangel an experimentellen Methoden, um solche Sequenzen, die Riboswitches genannt werden, zu identifizieren. In dieser Arbeit wird mit der affinitätsbasierten chemischen Transkriptomanalyse (ABC Transkriptomanalyse) ein neuartiger, experimenteller Ansatz zur Isolierung und Identifikation unbekannter Metaboliten-bindender RNA-Sequenzen vorgestellt. Diese Methode beruht auf der Verwendung von Photoaffinitätssonden. Diese Sonden enthalten ein Metabolitanalogon, dessen spezifische Affinität zu bestimmten RNA-Aptameren eine photoreaktive Gruppe in die Nachbarschaft dieser Sequenzen dirigiert. Daraufhin können durch Bestrahlung mit UV-Licht spezifische Crosslinks erzeugt werden. Die entsprechenden Oligonukleotide können anschließend in einer Probe mit Total-RNA über eine Affinitätschromatographie angereichert werden. Für die Entwicklung von Photoaffinitätssonden, die an den bekannten Lysin-Riboswitch binden, wurde die Größe der Bindungstasche mit Hilfe säuremodifizierter Lysinanaloga sondiert. So konnte nach der Synthese dieser Moleküle und dem molekularbiologischen Nachweis ihrer Bindung an den Riboswitch das gängige Bindungsmodell erweitert werden. Für Lysinanaloga, welche durch Derivatisierung keine negative Ladung der Säurefunktion aufweisen, bleibt die Affinität zum Riboswitch erhalten, so lange der Substituent eine gewisse Größe nicht übersteigt. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse und den Literaturdaten wurden im Folgenden drei Lysin- Photoaffinitätssonden synthetisiert, die sich bei identischer photoreaktiver Gruppe in ihrer Verknüpfung mit dem Metaboliten und ihrer Anreicherungsfunktion unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass die Sonden spezifisch an das Aptamer des Riboswitches binden und bei Bestrahlung mit UV-Licht einen spezifischen Crosslink ausbilden. Um mehr Erkenntnisse über Photoaffinitäts-Crosslinking zu erhalten, wurde das künstliche cAMPAptamer studiert. Bei diesem konnte mit cAMP-Photoaffinitätssonden ein hochspezifischer Crosslink generiert werden. Dadurch kann die Sequenz des Aptamers um das bis zu 33fache angereichert werden gegenüber einer Probe, in der die spezifische Bindung kompetitiv inhibiert wurde. Dieser Anreicherungsfaktor war auch in Proben mit Gesamt-RNA hinreichend stabil, so dass im Anschluss an ein Adapter-Ligations-Protokoll zur Einführung von Primer-Bindestellen mittels qPCR der Funktionsbeweis der ABC Transkriptomanalyse erbracht werden konnte. Mit dieser Methode wurde die Basis zur Isolierung und Identifikation neuer Metaboliten-bindender RNA-Motive gelegt. In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wird eine neue Methode zur RNA-Strukturanalyse durch fluoreszentes In-Line Probing gezeigt. Die Methode ermöglicht zum einen den Ersatz radioaktiver Markierungen durch Fluoreszenzfarbstoffe in In-Line Probing-Bindungsstudien an Riboswitch- Aptameren. Zum zweiten konnte gezeigt werden, dass hochmodifizierte, kleine RNAs, wie sie häufig in FRET- oder analogen biophysikalischen Studien verwendet werden, mit dieser Methode in einer Einzelnukleotidauflösung studiert werden können. Dadurch kann unter Ausnutzung der beiden bereits im Molekül befindlichen fluoreszenten Markierungen (terminal und intern) deren und der Einfluss weiterer Modifikationen auf die Struktur des Ribozyms direkt untersucht werden.
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/12953/
A1  - Strauß, Benjamin
ER  -