%0 Generic
%A Alhamdani, Mohamed Saiel Saeed
%D 2012
%F heidok:13638
%K Antibody microarray , proteomics , oncoproteomics , cellular proteomics
%R 10.11588/heidok.00013638
%T Antibody microarray-based cellular oncoproteomics
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/13638/
%X Seit ihrer kürzlichen Einführung haben sich Antikörper-Microarrays schnell als leistungsstarke, robuste und empfindliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen des Proteoms etabliert. Sie erlauben ein breites Spektrum an Anwendungen, mit Schwerpunkt im Bereich biomedizinischer Wissenschaft und klinischer Forschung. Allerdings waren Antikörper-Microarrays bisher hauptsächlich für die Analyse von Serum- und Urinproben ausgelegt. Zell-Lysate und Gewebe-Extrakte stellten eine große Herausforderung hinsichtlich Qualität und Verlässlichkeit dar. In der hier präsentierten Arbeit wurden eine Reihe technischer Aspekte zur Anwendungsreife gebracht, die für eine Analyse von Zell-Extrakten essenziell sind, und für Studien an Tumorzellen und Krebsgeweben genutzt. Die Extraktion einer möglichst vollständigen Repräsentation eines zellulären Proteoms ist ein kritischer Schritt für jede Art der Proteinanalyse. Zwar gab es bereits Methoden und entsprechende Reagenzien sind kommerziell erhältlich, aber die vorhandenen Verfahren für ein Proteinextraktion aus Zellen und Geweben waren völlig unzureichend für Studien mit Antikörper-Microarrays und wurden deshalb detailliert bearbeitet. Als Ergebnis wurde ein effektives Ein-Schritt-Extraktionsverfahren von hoher Reproduzierbarkeit entwickelt, das es erlaubt, Proteine unter nativen Bedingungen aus Zellen und Geweben zu isolieren. Im Vergleich zu bekannten Methoden sind die Ausbeuten signifikant besser, speziell auch für membran-assoziierte Proteine und Moleküle aus Zellkompartimenten. Gleichzeitig wird die Funktionalität der Proteine wesentlich besser erhalten. Die mit dem Protokoll gewonnenen Proteinextrakte zeigen eine hohe Kompatibilität mit Studien auf Antikörper-Microarrays. Zusätzlich wurden Parameter der Array-Analyse untersucht und optimiert, so dass eine robuste Analyse von komplexen zellulären Proteinextrakten möglich wurde. Unter anderem wurden Faktoren wie (i) die Pufferzusammensetzung zur Blockierung der Oberflächen gegen unspezifische Bindung, (ii) die Dauer der Blockierung, (iii) Proteinhandhabung und Prozessierung, (iv) Parameter des arkierungsprozesses und des Entfernens überschüssigen Farbstoffs, als auch (v) Inkubationsparameter wie etwa Pufferzusammensetzung, Dauer, Temperatur und Probenmischung analysiert und optimiert. Mit den entwickelten Verfahren wurden die Proteome von 24 Pankreaskrebs Zelllinien und zwei Kontroll-Zelllinien mittels eines Microarrays untersucht, der 810 Antikörper gegen 741 Proteine trug, die mit Krebserkrankungen assoziiert sind. Weiterhin wurden in einer Studie zum Verständnis der molekularen Hintergründe von Pankreaskrebs mehr als vierhundert Gewebeproben von Tumorpatienten und aus gesundem Gewebe analysiert.