<> "The repository administrator has not yet configured an RDF license."^^ . <> . . "Kinetische und Mechanistische Charakterisierung eines Diels-Alderase-Ribozyms"^^ . "Zusammenfassung Stefanie Kraut, Diplom-Lebensmittelchemikerin Kinetische und Mechanistische Charakterisierung eines Diels Alderase-Ribozyms 1. Gutachter: Prof. Dr. Andres Jäschke, 2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Wölfl Mit der Entdeckung der Ribozyme als katalytisch-aktive RNAs entstand mit der „RNA-Welt“-Hypothese ein neues Verständnis über die Entstehung des Lebens. RNA kann demnach genetische Information codieren und speichern, sowie katalytische Funktionen in Zellen übernehmen. Die Entwicklung von in vitro-Selektionstechniken ermöglichte die Selektion synthetischer Ribozyme mit großem katalytischem Potential. Das in unserer Gruppe selektierte Diels-Alderase-Ribozym katalysiert stereoselektiv neue Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen einem Anthracen und einem Maleimid. In der vorliegenden Arbeit wurde das Diels-Alderase-Ribozym auf seine kinetische und mechanistische Funktionsweise untersucht. In der Kristallstruktur des Diels-Alderase-Ribozyms wurden divalente Ionen-bindungsstellen identifiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss divalenter Ionen auf die katalytische Ribozym-Aktivität mit einem UV/VIS-spektroskopischen Assay quantitativ untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass für die vollständige katalytische Aktivität eine größere Anzahl an divalenten Ionen neben denen zur Besetzung der hochaffinen Bindungsstellen erforderlich sind. Mn2+-Ionen als Substitution von Mg2+-Ionen führten zur Reduktion der katalytischen Ribozym-Aktivität auf die Hälfte. Obwohl Cd2+-Ionen die höchste Bindungsaffinität aufwiesen, trat keinerlei Ribozym-Aktivität auf. Die quantifizierende Analyse der Diels-Alder-Reaktionen mittels HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie) zeigte, dass etwa die Hälfte des konsumierten Anthracen-Substrats nicht zu Diels-Alder-Produkt reagierte. Zur Aufklärung möglicher Nebenreaktionen wurde die sensitive, hochauflösende Molekülmassen-Bestimmung mittels LC-MS (HPLC-Massenspektrometrie) für die Diels-Alder-Reaktion etabliert. Sauerstoff-Addukte und Dimere der Anthracen-Komponente konnten identifiziert werden, die auch eine Bedeutung in Nebenreaktionen haben könnten. In weiterführenden Studien sollte dies noch genauer untersucht werden. Wasserstoff-Brücken-Bindungen (H Brücken) wurden aus der Kristallstruktur innerhalb der katalytischen Tasche des Ribozyms und zwischen der katalytischen Tasche und dem Diels-Alder-Produkt abgeleitet. Ein Teil dieser Arbeit umfasste die Aufklärung der Bedeutung der H-Brücken zur Stabilität, katalytischen Ribozym-Aktivität und hohen Produkt-Inhibition. Durch atomare Mutagenese eingeführte Nukleotid-Modifikationen im Ribozym wurden zur Störung der H-Brücken eingesetzt. Die Effekte dieser Störungen wurden mit dem chemischen Blei-Ionen Probing und einem radioaktiven gelelektrophoretischen Assay analysiert. Die strukturelle Analyse zwischen dem Wildtyp und einem modifizierten Ribozym mit gestörter H-Brücke, die die Verbindung zwischen „Dach“ und „Rückgrat“ der katalytischen Tasche bildet, ergab eine ähnliche Gesamtstruktur der Ribozyme. Das modifizierte Ribozym konnte jedoch in Anwesenheit von Diels-Alder-Produkt und Mg2+-Ionen keine Strukturstabilisierung ausbilden. Aus diesem Verhalten konnte die hohe Relevanz dieser einen H-Brücke und deren nötige präzise Positionierung zur Ausbildung der intakten katalytischen Tasche abgeleitet werden. Die Doppelmutanten wiesen nur 4-5% der Wildtyp-Aktivität auf, was die hohe Relevanz der H-Brücken zwischen Ribozym und Diels-Alder-Produkt für die katalytische Aktivität indizierte. Aus dem Vergleich der Einzel- und Doppelmutanten wurde der additive Beitrag beider H-Brücken zur katalytischen Aktivität des Ribozyms abgeleitet. Die Ribozym - Produkt H-Brücken konnten mittels UV/VIS-Spektroskopie als Verursacher der hohen Produkt-Inhibition identifiziert werden. Diese Arbeit konnte das Verständnis der Funktionsweise des Diels-Alderase-Ribozyms in Bezug der H-Brücken und divalenten Ionen auf die Stabilität und die katalytische Aktivität vertiefen. Mit der Etablierung der LC-MS-Methode für Diels-Alder-Reaktionen wurde die Grundlage zur hochauflösenden massenspektrometrischen Analyse der Reaktionen gelegt."^^ . "2012" . . . . . . . . "Stefanie"^^ . "Kraut"^^ . "Stefanie Kraut"^^ . . . . . . "Kinetische und Mechanistische Charakterisierung eines Diels-Alderase-Ribozyms (Other)"^^ . . . . . . "indexcodes.txt"^^ . . . "Kinetische und Mechanistische Charakterisierung eines Diels-Alderase-Ribozyms (PDF)"^^ . . . "Dissertation_final_eingereicht_uploaded.pdf"^^ . . . 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