eprintid: 13972 rev_number: 14 eprint_status: archive userid: 134 dir: disk0/00/01/39/72 datestamp: 2012-11-14 10:40:10 lastmod: 2012-12-03 07:50:14 status_changed: 2012-11-14 10:40:10 type: doctoralThesis metadata_visibility: show creators_name: Eichelbaum, Katrin title: Quantitative proteomics of transcriptional and translational regulation title_de: Quantitative Proteomik der transkriptionalen und translationalen Regulierung subjects: ddc-570 divisions: i-140001 divisions: i-850800 adv_faculty: af-14 keywords: Proteomics Mass spectrometry Secretome analysis Protein synthesis Macrophages abstract: Transcription and translation are precisely-regulated processes that enable a cell to react to environmental stimuli by the production of appropriate sets of proteins. In order to analyze gene expression regulation, two novel methods have been developed that facilitate affinity purification approaches in combination with quantitative mass spectrometry. First, the concepts underlying transcriptional control are investigated by identifying proteins binding to cis-regulatory modules (CRMs) in a sequence-specific manner. The method facilitated the determination of proteins specifically binding to DNA sequences with a length of 500 base pairs. Quantitative comparison of the binding pattern of three CRMs active in Drosophila melanogaster muscle development revealed 72 candidates potentially regulating the activity of these CRMs among thousands of proteins that interact non-specifically. In vivo validation of biological activity of several candidates is in progress and will probably reveal new circuits of Drosophila melanogaster muscle development. Second, a novel approach to specifically enrich and quantify newly synthesized proteins by combining click-chemistry and pulsed SILAC labeling was developed. This method was introduced as a useful tool to study protein synthesis and the sensitive detection of rapid response to cellular stimulation. In addition, the method was adapted to the selective and precise quantification of secreted proteins. This important subset of mammalian proteins is currently understudied because of technical limitations in the detection of low-abundant proteins against a background of serum. In-depth and differential secretome analysis of various cell lines and primary cells revealed, e.g., profound effects of serum starvation on secretome composition. Moreover, a unique application studying the kinetics of protein secretion was introduced. The approach will have broad implications in studying the responsiveness of cells grown under optimal conditions. Finally, in combination with RNA and protein abundance measurements, the developed approaches were used to investigate regulatory mechanism establishing response programs in lipopolysaccharides stimulated mouse macrophages with temporal resolution. These data for the first time provide a comprehensive view on the kinetics of macrophage activation. Transcriptional, translational and localization regulation was distinguished and starting points for further investigation of these mechanisms were proposed. abstract_translated_text: Die durch Stimulierung aktivierte Proteinsynthese ermöglicht es Zellen flexibel auf Umweltfaktoren zu reagieren und wird von präzise kontrollierten Mechanismen, der Transkription und der Translation, bestimmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden der Proteinanreicherung in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie zur Analyse der Genexpression entwickelt. Transkriptionale Kontrollmechanismen wurden durch die Analyse von sequenz-spezifisch DNA-bindenden Proteinen studiert. Die vorgestellte Methode erlaubt die Verwendung von langen DNA-Sequenzen (500 Basenpaare). Der Vergleich der Interaktionsprofile von cis-regulatorischen Modulen (CRMs), welche die embryonale Entwicklung von Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) steuern, ergab - neben tausenden unspezifisch bindenden Proteinen - 72 potentielle Regulatoren dieses Prozesses. Die in vivo Validierung dieser Kanditaten ist in Arbeit und wird neue Kontrollmechanismen der embryonalen Entwicklung in diesem Modellsystem aufdecken. Die zweite, neu entwickelte Methode kombiniert Klick-Chemie und metabolische Proteinmarkierung zur selektiven Anreicherung und Quantifizierung von neu synthetisierten Proteinen. Die Analyse von aktivierten Mausmakrophagen ergab eine hohe Empfindlichkeit auf schnelle Änderungen des Proteoms. Zusätzlich wurde die Methode an die selektive und exakte Quantifizierung von sezernierten Proteinen angepasst und ermöglicht nun den Nachweis einer Proteinklasse, deren Analyse aufgrund der hohen Hintergrundkonzentration an Serumproteinen sehr anspruchsvoll ist. Die vergleichende Sekretomanalyse von verschiedenen Zelllinien und primären Zellen ergab unter anderem einen hohen Einfluss des Serumentzugs auf die Proteinsekretion. Zusätzlich wurde eine neue Strategie zur Untersuchung der Sekretionskinetik eingeführt. Mit Hilfe der vorgestellten Methode können zelluläre Reaktionen unter optimalen Wachstumsbedingungen studiert werden. Desweiteren wurden RNA- und Proteinabundanzmessungen mit den beschriebenen Methoden kombiniert, um die Aktivierungsmechanismen in Lipopolysaccharid-stimulierten Mausmakrophagen zeitlich aufgelöst zu untersuchen. Die Ergebnisse ermöglichen die Unterscheidung von transkriptionaler, translationaler und räumlicher Kontrolle und ergeben erstmalig ein umfassendes Bild der Zusammenhänge von RNA- und Proteinkinetik in diesem Modellsystem. Außerdem wurden Ansatzpunkte zur Erforschung spezieller Kontrollmechanismen vorgeschlagen. abstract_translated_lang: ger date: 2012-11-08 id_scheme: DOI id_number: 10.11588/heidok.00013972 ppn_swb: 1651909997 own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-139729 date_accepted: 2012-11-08 advisor: HASH(0x559e37cadc60) language: eng bibsort: EICHELBAUMQUANTITATI20121108 full_text_status: public citation: Eichelbaum, Katrin (2012) Quantitative proteomics of transcriptional and translational regulation. [Dissertation] document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/13972/1/thesis_eichelbaum.pdf