%0 Generic
%A Arntjen, Anja 
%D 2013
%F heidok:15709
%K Apple stem pitting virus, Apple stem grooving virus, Volllängen cDNA Klon, Circular Polymerase Extension Cloning 
%R 10.11588/heidok.00015709
%T Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum  
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/15709/
%X Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein infektiöser Volllängen cDNA Klon des Apple stem pitting virus (ASPV) hergestellt werden, mit dem die Ätiologie der  hervorgerufenen Krankheitsbilder untersucht werden kann. Dazu sollte zum einen die klassische Methode der Ligationsstrategie genutzt werden. Sie basiert auf  spezifischen Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das Genom aus mehreren  Fragmenten im Zielvektor zusammengesetzt wird (Prüfer et al. 1995). Für diese  Methode ist es unerlässlich die komplette Sequenz des Virus zu kennen, um die  Restriktionsschnittstellen auswählen zu können. Zum anderen sollte eine Methode  entwickelt werden, die weniger zeit- und kostenintensiv ist und die Probleme, die in  der Ligationsstrategie auftreten können, umgeht. Dazu gehört die hohe  Sequenzvariabilität, die bei den latenten Apfelviren auftritt, welche dazu führt, dass  das verwendete Isolat vorher sequenziert werden muss (Yoshikawa 2009). Des  Weiteren können die während der Ligationsstrategie entstandenen Konstrukte in den  Bakterien instabil oder toxisch sein (Ülper et al. 2008). Die entwickelte Methode sollte  auf das Apple stem grooving virus (ASGV) angewendet werden.  Für die Herstellung eines Volllängen cDNA Klons des ASPV wurde das Isolat PB66  verwendet. Die Ligationsstrategie wurde mit Hilfe der Sequenz des Isolates PA66  entwickelt. Bereits während der Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion  (PCR) traten Probleme auf, die dazu führten, dass die komplette Sequenz des  Isolates PB66 bestimmt wurde. Dabei stellte sich heraus, dass die beiden Isolate  eine Sequenzidentität von 80 % haben. Anhand der neuen Sequenz wurde eine  Ligationsstrategie entwickelt, mit der erfolgreich ein Volllängen cDNA Klon des ASPV  unter der Kontrolle des 35S Promotors hergestellt werden konnte. Das Konstrukt  wurde in einem weiteren Schritt in einen pBin Vektor umligiert. In den  anschließenden Infektionsversuchen mittels mechanischer Inokulation und  Agroinokulation war dieser nicht infektiös. Die Sequenzierung des entstandenen  Volllängen cDNA Klons zeigte ein verändertes 5'- Ende und 19 weitere  Basenaustausche innerhalb der Sequenz.  Als weitere Methode sollte die Volllängen PCR genutzt werden, dazu wurden Primer  am 5'- und 3'- Ende des ASPV Isolates PB66 abgeleitet. Beim Vergleich von 5'- und  3'- Enden von verschiedenen ASPV Isolaten konnte eine erhöhte Konserviertheit  festgestellt werden, welche es ermöglicht, die erstellten Primer zur Herstellung von  15  Volllängen PCR Produkten von verschiedenen ASPV Isolaten zu nutzen. In der PCR  konnte das komplette Genom amplifiziert werden. Die Ligation des 9 kb großen PCR  Fragmentes gelang nicht. Als Abänderung in der Volllängen PCR wurde dem  'forward' Primer die Sequenz des T7 Promotors angefügt. Dadurch konnten in der T7  PCR infektiöse RNA Transkripte generiert werden. Die Volllängen PCR wurde auf  ASGV angewendet. Es konnte das komplette 6,5 kb große Genom amplifiziert  werden. Die Ligation des PCR Produktes war auch hier nicht erfolgreich. Durch  Hinzufügen des T7 Promotors an den 'forward' Primer konnten mit den Volllängen  PCR Produkten in der T7 PCR infektiöse Transkripte hergestellt werden. Durch  mechanische Inokulation mit den T7 PCR Ansätzen konnten in beiden Fällen in dem  experimentellen Wirt Nicotiana occidentalis 37B Symptome ausgelöst werden. Die  Infektion mit ASPV und ASGV wurde durch PCR Nachweise und elektronenmikroskopische  Untersuchungen belegt.  Als weitere Methode wurde das Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC)  verwendet (Quan and Tian 2009). Hierbei wurde an die Primer für die Volllängen  PCR ein Stück Vektorsequenz angehängt. Diese überlappenden Bereiche dienen in  einer Fusions- PCR als Ausgangspunkt für die Polymerase. Mit Hilfe dieser Methode  konnten infektiöse Volllängen cDNA Klone des ASPV und ASGV in einem pBin  Vektor hergestellt werden. Nach Agroinokulation zeigten sich auf den  Versuchspflanzen Symptome. Die Infektion wurde durch PCR und das Elektronenmikroskop  belegt. Die Infektionsrate lag bei dem ASPV Klon bei 3 % und bei dem  ASGV Klon bei 22 %.  In dieser Arbeit wurden infektiöse Volllängen cDNA Klone der latenten Apfelviren  ASPV und ASGV mit der CPEC Methode hergestellt. Beide Klone könnten in  weiteren Versuchen für die Erforschung der Ätiologie der durch die Viren  hervorgerufenen Krankheiten genutzt werden. Des Weiteren wurde ein Versuch zur  Nachweisbarkeit von ASPV über den gesamten Jahresverlauf in verschiedenen  Apfelbaumgeweben durchgeführt, in dem sich Phloem als das zuverlässigste  Gewebe zur Detektion von ASPV gezeigt hat. Die Nachweisbarkeit von ASPV, Apple  chlorotic leaf spot virus (ACLSV) und ASGV in Mischinfektionen wurde ebenfalls über  einen längeren Zeitraum überprüft.