<> "The repository administrator has not yet configured an RDF license."^^ . <> . . "Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum\r\n"^^ . "Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein infektiöser Volllängen cDNA Klon des Apple stem pitting virus (ASPV) hergestellt werden, mit dem die Ätiologie der\r\nhervorgerufenen Krankheitsbilder untersucht werden kann. Dazu sollte zum einen die klassische Methode der Ligationsstrategie genutzt werden. Sie basiert auf\r\nspezifischen Restriktionsschnittstellen mit deren Hilfe das Genom aus mehreren\r\nFragmenten im Zielvektor zusammengesetzt wird (Prüfer et al. 1995). Für diese\r\nMethode ist es unerlässlich die komplette Sequenz des Virus zu kennen, um die\r\nRestriktionsschnittstellen auswählen zu können. Zum anderen sollte eine Methode\r\nentwickelt werden, die weniger zeit- und kostenintensiv ist und die Probleme, die in\r\nder Ligationsstrategie auftreten können, umgeht. Dazu gehört die hohe\r\nSequenzvariabilität, die bei den latenten Apfelviren auftritt, welche dazu führt, dass\r\ndas verwendete Isolat vorher sequenziert werden muss (Yoshikawa 2009). Des\r\nWeiteren können die während der Ligationsstrategie entstandenen Konstrukte in den\r\nBakterien instabil oder toxisch sein (Ülper et al. 2008). Die entwickelte Methode sollte\r\nauf das Apple stem grooving virus (ASGV) angewendet werden.\r\nFür die Herstellung eines Volllängen cDNA Klons des ASPV wurde das Isolat PB66\r\nverwendet. Die Ligationsstrategie wurde mit Hilfe der Sequenz des Isolates PA66\r\nentwickelt. Bereits während der Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion\r\n(PCR) traten Probleme auf, die dazu führten, dass die komplette Sequenz des\r\nIsolates PB66 bestimmt wurde. Dabei stellte sich heraus, dass die beiden Isolate\r\neine Sequenzidentität von 80 % haben. Anhand der neuen Sequenz wurde eine\r\nLigationsstrategie entwickelt, mit der erfolgreich ein Volllängen cDNA Klon des ASPV\r\nunter der Kontrolle des 35S Promotors hergestellt werden konnte. Das Konstrukt\r\nwurde in einem weiteren Schritt in einen pBin Vektor umligiert. In den\r\nanschließenden Infektionsversuchen mittels mechanischer Inokulation und\r\nAgroinokulation war dieser nicht infektiös. Die Sequenzierung des entstandenen\r\nVolllängen cDNA Klons zeigte ein verändertes 5'- Ende und 19 weitere\r\nBasenaustausche innerhalb der Sequenz.\r\nAls weitere Methode sollte die Volllängen PCR genutzt werden, dazu wurden Primer\r\nam 5'- und 3'- Ende des ASPV Isolates PB66 abgeleitet. Beim Vergleich von 5'- und\r\n3'- Enden von verschiedenen ASPV Isolaten konnte eine erhöhte Konserviertheit\r\nfestgestellt werden, welche es ermöglicht, die erstellten Primer zur Herstellung von\r\n15\r\nVolllängen PCR Produkten von verschiedenen ASPV Isolaten zu nutzen. In der PCR\r\nkonnte das komplette Genom amplifiziert werden. Die Ligation des 9 kb großen PCR\r\nFragmentes gelang nicht. Als Abänderung in der Volllängen PCR wurde dem\r\n'forward' Primer die Sequenz des T7 Promotors angefügt. Dadurch konnten in der T7\r\nPCR infektiöse RNA Transkripte generiert werden. Die Volllängen PCR wurde auf\r\nASGV angewendet. Es konnte das komplette 6,5 kb große Genom amplifiziert\r\nwerden. Die Ligation des PCR Produktes war auch hier nicht erfolgreich. Durch\r\nHinzufügen des T7 Promotors an den 'forward' Primer konnten mit den Volllängen\r\nPCR Produkten in der T7 PCR infektiöse Transkripte hergestellt werden. Durch\r\nmechanische Inokulation mit den T7 PCR Ansätzen konnten in beiden Fällen in dem\r\nexperimentellen Wirt Nicotiana occidentalis 37B Symptome ausgelöst werden. Die\r\nInfektion mit ASPV und ASGV wurde durch PCR Nachweise und elektronenmikroskopische\r\nUntersuchungen belegt.\r\nAls weitere Methode wurde das Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC)\r\nverwendet (Quan and Tian 2009). Hierbei wurde an die Primer für die Volllängen\r\nPCR ein Stück Vektorsequenz angehängt. Diese überlappenden Bereiche dienen in\r\neiner Fusions- PCR als Ausgangspunkt für die Polymerase. Mit Hilfe dieser Methode\r\nkonnten infektiöse Volllängen cDNA Klone des ASPV und ASGV in einem pBin\r\nVektor hergestellt werden. Nach Agroinokulation zeigten sich auf den\r\nVersuchspflanzen Symptome. Die Infektion wurde durch PCR und das Elektronenmikroskop\r\nbelegt. Die Infektionsrate lag bei dem ASPV Klon bei 3 % und bei dem\r\nASGV Klon bei 22 %.\r\nIn dieser Arbeit wurden infektiöse Volllängen cDNA Klone der latenten Apfelviren\r\nASPV und ASGV mit der CPEC Methode hergestellt. Beide Klone könnten in\r\nweiteren Versuchen für die Erforschung der Ätiologie der durch die Viren\r\nhervorgerufenen Krankheiten genutzt werden. Des Weiteren wurde ein Versuch zur\r\nNachweisbarkeit von ASPV über den gesamten Jahresverlauf in verschiedenen\r\nApfelbaumgeweben durchgeführt, in dem sich Phloem als das zuverlässigste\r\nGewebe zur Detektion von ASPV gezeigt hat. Die Nachweisbarkeit von ASPV, Apple\r\nchlorotic leaf spot virus (ACLSV) und ASGV in Mischinfektionen wurde ebenfalls über\r\neinen längeren Zeitraum überprüft.\r\n"^^ . "2013" . . . . . . . "Anja "^^ . "Arntjen"^^ . "Anja Arntjen"^^ . . . . . . "Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum\r\n (PDF)"^^ . . . "Dissertation A. Arntjen.pdf"^^ . . . "Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum\r\n (Other)"^^ . . . . . . "indexcodes.txt"^^ . . . "Herstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum\r\n (Other)"^^ . . . . . . "lightbox.jpg"^^ . . . 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"HTML Summary of #15709 \n\nHerstellung infektiöser in vitro Transkripte und Volllängen cDNA Klone von Apple stem pitting virus (ASPV) und Apple stem grooving virus (ASGV) und Untersuchungen zur jahreszeitlichen Nachweisbarkeit dieser Viren im Apfelbaum \n\n\n" . "text/html" . . . "570 Biowissenschaften, Biologie"@de . "570 Life sciences"@en . .