title: Doppelstrangbruch-Induktion und DNA-Schadensantwort nach 12C-Ionen und Photonenstrahlung in U87 Glioblastomzellen 
creator: Lopez Perez, Ramon
subject: ddc-500
subject: 500 Natural sciences and mathematics
subject: ddc-570
subject: 570 Life sciences
subject: ddc-600
subject: 600 Technology (Applied sciences)
description: Schwerionenstrahlung entfaltet bei gleicher physikalischer Dosis eine höhere biologische Wirksamkeit als Photonenstrahlung. In dieser Arbeit wurden die Ursachen dafür anhand der DNA-Schadensantwort in U87 Glioblastomzellen untersucht. Ausschlaggebend sind hierbei DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), deren Induktion und Reparatur durch Messung des DSB-Markers γH2AX (phosphoryliertes Histon H2AX) im Kontext des Zellzyklus verfolgt wurde. Weiter wurde untersucht, ob es strahlenspezifische Unterschiede in der Wahl des DSB-Reparaturmechanismus gibt, und welche Folgen beim Scheitern der Reparatur eintreten. Die Untersuchungen ergaben, dass 12C-Ionen-Strahlung schwerer zu reparierende DSBs erzeugt als Photonenstrahlung, die etwas verzögert und langsamer repariert werden. Dies bewirkte stärker ausgeprägte und länger anhaltende Zellzyklusblockaden, vorwiegend am G2/M-Übergang, sowie eine höhere Apoptoserate bei 12C-Ionen-Strahlung. Autophagozytose als alternativer Weg des programmierten Zelltods spielte bei beiden Strahlenarten keine Rolle. Die Wirkung der 12C-Ionen hing weniger stark von der Zellzyklusphase ab als bei Photonenstrahlung. Dies zeigte sich besonders deutlich anhand der DSB-Reparaturgeschwindigkeit in der S- und G2-Phase. Die Zellen waren bei 12C-Ionen-Strahlung stärker auf die Reparatur durch homologe Rekombination (HRR) angewiesen als bei Photonenstrahlung, auch wenn in beiden Fällen vermutlich der Mechanismus der Nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung dominierte.  Die Ursache dafür, dass 12C-Ionen- gegenüber Photonenstrahlung schwerer zu reparieren-de DSBs erzeugte, die langsamer und eher durch HRR repariert wurden, war höchstwahrscheinlich eine stärkere Clusterung der DSBs aufgrund der höheren Ionisationsdichte von 12C-Ionen-Strahlung. Die mikroskopische Untersuchung von immunfluoreszent markiertem γH2AX zeigte, dass die DSB-Reparaturfoci bei 12C-Ionen-Strahlung größer waren und mehr γH2AX -Moleküle enthielten (stärkere Fluoreszenz), obwohl ihre Anzahl vor Abschluss der Reparatur geringer war. Neben den Foci wurde auch ein schwächeres pan-nukleäres γH2AX -Signal beobachtet, das linear mit der Strahlendosis anstieg und bei 12C-Ionen-Strahlung stärker ausgeprägt war als bei Photonenstrahlung. Pan-nukleäres γH2AX als Folge von ionisierender Strahlung wird mit kleinen DNA-Fragmenten in Zusammenhang gebracht. Diese Indizien sprachen dafür, dass die Clusterung der DSBs, und nicht allein ihre Anzahl, aus-schlaggebend für die hohe relative biologische Wirksamkeit der 12C-Ionen-Strahlung ist.  Weitere Hinweise auf geclusterte DSBs nach 12C-Ionen-Strahlung lieferten Untersuchungen der Reparaturfoci nach Immunfärbung von γH2AX und dem HRR-Enzym pBRCA1 mit Hilfe superauflösender Mikroskopie. Hierzu wurden die Zellen mit einzelnen bis einigen wenigen 12C-Ionen unter einem flachen Winkel bestrahlt. Durch Einsatz von strukturierter Beleuchtung (SIM) gelang es die Foci und ihren Kolokalisationsgrad im Verlauf der Reparatur mit einer hohen Genauigkeit jenseits der klassischen Auflösungsgrenze in 3D zu vermessen.  Neben den primär entlang der Ionenflugbahn induzierten Foci traten nach 26h neue Sekundärfoci auf. Diese waren abweichend von der Ionenflugbahn verteilt und gingen vermutlich im Zuge der DNA-Replikation aus verbleibenden Nicht-DSB-Schäden hervor. In Übereinstimmung mit der Abhängigkeit solcher Sekundärfoci von der Reparatur durch Bruch-induzierte Replikation, einer Sonderform der HRR, wiesen die sekundären γH2AX Foci einen besonders hohen Kolokalisationsgrad mit pBRCA1 auf. Die innere Struktur der γH2AX Foci wurde mit SPDMPhymod, einer weiteren superauflösenden Mikroskopietechnik untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass die Foci, die Größen bis über 1,5 µm³ erreichen, nicht homogen aufgebaut sind, sondern über eine feine Substruktur verfügen. Demnach bestehen die Foci aus vielen Subfoci in der Größenordnung von 100nm mit teilweise länglicher Gestalt. Passend zur Organisation des Chromatins in dicht gepackten Schlaufen mit Interchromatin-Lücken ließen sich unterschiedliche Verläufe und Abstände zwischen den Subfoci erkennen.  
date: 2015
type: Dissertation
type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
type: NonPeerReviewed
format: application/pdf
identifier: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserverhttps://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/18722/1/Doktorarbeit.pdf
identifier: DOI:10.11588/heidok.00018722
identifier: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-187222
identifier:   Lopez Perez, Ramon  (2015) Doppelstrangbruch-Induktion und DNA-Schadensantwort nach 12C-Ionen und Photonenstrahlung in U87 Glioblastomzellen.  [Dissertation]     
relation: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/18722/
rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
rights: http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/help/license_urhg.html
language: ger