%0 Generic
%A Zimmermann, Philipp Konstantin
%D 2016
%F heidok:18830
%K DNA Doppelstrangbruch, Genomische Instabilität, Bestrahlung
%R 10.11588/heidok.00018830
%T Genome‐wide detection of induced DNA double strand breaks
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/18830/
%X DNA Doppelstrangbrüche (DSB) können sowohl natürlich als auch nach Bestrahlung auftreten und stellen eine  große Gefahr für die Stabilität des Genoms und Zellviabilität dar. Wird ein DSB nicht effizient repariert, können  Veränderungen im Genom wie z.B. Deletionen und Vervielfältigungen auftreten, die ein Markenzeichen von  Krebszellen sind. Ist der DNA Schaden allerdings zu groß, kann die Zelle Apoptose induzieren, was das Ziel der  Strahlentherapie zur Krebsbehandlung ist. Derzeitige Methoden zur Bestimmung von DSB basieren vor allem auf  der Markierung von DNA Reparaturproteinen wie ATM (Ataxia telangiectasia mutated), 53BP1 (53 binding  protein 1) und H2AX (phosphoryliertes Histon H2AX) mittels Fluoreszenz‐markierten Antikörpern. Diese  Proteine bilden innerhalb weniger Minuten nach der DSB Entstehung mikroskopisch‐sichtbare Zentren an der  DSB Stelle, sogenannte Strahlen‐induzierte Zentren (RIF). Obwohl diese Methode Erkenntnisse über die DSB  Entstehung und Reparaturkinetik geliefert hat, ist sie limitiert. So kann keine Aussage über die genaue Position  des Strangbruchs getroffen werden, da die RIF auf mehrere Megabasen um die DSB Stelle herum vergrößern.  Außerdem verschwinden die RIF innerhalb von 24 Stunden nach Bestrahlung, und ermöglichen somit keine  weitere Analyse der reparierten DSB Stellen in überlebenden Zellen. Ebenso erlaubt die Immunfärbung keine  Aussage über einen möglichen Zusammenhang zwischen der DSB Stelle, der Reparatur und des Schicksals der  Zelle. Daher gibt es kaum Informationen darüber, wie Strahlen‐induzierte DSB im Genom verteilt sind, wie solche  Schäden zur Radioresistenz führen sowie die Entwicklung von einer normalen Zelle hin zu einer Tumorzelle und  die Krebsentstehung beeinflussen. Deshalb stellen wir die Hypothese auf, dass DSB im Genom nicht zufällig  verteilt sind und dass die Analyse der genom‐weiten DSB Verteilung nach Bestrahlung in überlebenden Zellen  auf Einzelnukleotidebene unser Verständnis über die Mechanismen, die zur Bestrahlungsresistenz führen,  verbessert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden in dieser Arbeit neue Methodenansätze basierend auf der  Beobachtung entwickelt, dass Non‐Homologous End Joining (NHEJ) Reparatur zum Einbau von DNA Molekülen  ins Genom an DSB Stellen führen kann. Für die DSB Markierung wurden daher Integrase‐defiziente lentivirale  Vektoren (IDLV) in Zellen eingebracht, die nach Bestrahlung an transient‐auftretenden DSB Stellen ins Genom  stabil eingebaut werden. Diese Integrationsstellen wurden anschließend durch LAM‐PCR und Sequenzierung  amplifiziert und identifiziert. Insgesamt wurden somit mehr als 20,000 DSB Stellen im Genom bestrahlter Zellen  identifiziert und mit natürlich‐auftretenden und Doxorubicin‐induzierten DSB Stellen verglichen. Die DSB  Verteilung wurde mit der Transkriptionsaktivität, verschiedenen Chromatin‐Bereichen und Genfunktionen  verglichen. Die Analyse ergab, dass in überlebenden Zellpopulationen das DSB‐Verteilungsmuster nicht zufällig  ist. Therapie‐induzierte DSB wurden vermehrt in kleinen genomischen Bereichen, sogenannten Hotspots, die in  Grenzregionen von Eu‐ und Heterochromatin und in oder in der Nähe von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen  und Enhancer Regionen liegen, nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Strahlen‐induzierte  Mutationen in überlebenden Zellpopulationen in bevorzugten Bereichen auftreten oder Zellen mit Mutationen  in solchen Bereichen selektiert werden. Diese Hotspots können eventuell die Wahrscheinlichkeit für die  Entstehung von Therapieresistenzen erhöhen.