eprintid: 2018 rev_number: 8 eprint_status: archive userid: 1 dir: disk0/00/00/20/18 datestamp: 2002-04-09 00:00:00 lastmod: 2014-04-03 11:40:48 status_changed: 2012-08-14 15:03:39 type: doctoralThesis metadata_visibility: show creators_name: Bräuning, Rüdiger title: Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen mittels Phage-Display title_en: Analysis of protein-protein-interactions via phage-display ispublished: pub subjects: ddc-570 divisions: i-721000 adv_faculty: af-14 keywords: phage-displayphage-display cterms_swd: phage-display abstract: Adenoviren docken in spezifischer Weise an ihren zellulären Rezeptor CAR an. Da Adenoviren als Vektoren bei der Gentherapie eingesetzt werden, ist es äußerst interessant, den genauen Bindungsmechanismus zwischen den Adenoviren und humanen Zellen besser zu verstehen. Mit diesem Wissen können die Vektoren, den jeweiligen Bedürfnissen entsprechend, modifiziert werden. Als erster und wichtigster Schritt hierfür sollten bindungsrelevante Aminosäuren identifiziert werden. Hierzu wurden die Epitope von vier neutralisierenden, gegen das adenovirale Knob-Protein gerichteten, Antikörpern bestimmt. Diese Epitope können mit der Knob-CAR-Interaktionsstelle identisch sein oder sie sterisch behindern und so die Bindung neutralisieren. Beide Möglichkeiten wurden gefunden. Die exklusive Erkennung trimeren Knobs durch die in dieser Studie benutzten Antikörper impliziert, dass die dreidimensionale Struktur von Knob essentiell ist. Eine Erklärung ist, dass die zugehörigen nicht-linearen Epitope nur gebildet werden, wenn mehr als eine Polypeptidkette des Knob-Proteins an der Bindung beteiligt ist. Eine andere Möglichkeit ist, dass die Trimerisierung zu konformationellen Änderungen in den monomeren Untereinheiten führt, welche dann die korrekte Präsentation der Aminosäuren des Epitops erlauben. Auch hier wurden wieder beide Möglichkeiten gefunden. Die über das Phage Display angereicherten Sequenzen konnten in der Aminosäuresequenz des Knob nicht als lineare Abfolge gefunden werden. Unter Zuhilfenahme der Kristallstruktur des Knob wurden Vorschläge für die Lokalisation der Antikörperepitope gemacht. Diese konnten durch die zwischenzeitlich verfügbaren Daten aus Kokristallisationsexperimenten (Knob-CAR) bestätigt werden. Zusammenfassend läst sich festhalten, dass für die untersuchten Antikörper Epitope vorgeschlagen und mit verschiedenen Methoden verifiziert wurden. Hierbei zeigte sich, dass nur die Kombination mehrerer Methoden erfolgversprechend ist. Um konformationelle Epitope in Zukunf abstract_translated_text: Adenoviruses bind in a specific way to their cellular receptor CAR. They are used as vectors in genetheraphy and therefore a more detailed understanding of the binding mechanism is important. This knowledge would help customizing vectors for specific needs. In a first step aminoacids that are essential for the binding had to be identified. Epitopes of four neutralising antibodies, directed against the anti-adenoviral knob protein, were mapped. These epitopes can be either identical to the knob-CAR bindingsite, or infer sterical hinderance and thereby neutralise the binding. Both possibilities were found. Exclusive recognition of trimeric knob by the analysed antibodies emphasizes the importance of the 3-dimensional structure of knob. One explanation could be that relevant non-linear epitopes are only formed if more than one polypeptide chain of the knob protein is involved in the binding. Another possibility would be that trimerisation leeds to conformational changes in the monomeric subunits thus enabling correct presentation of the epitopes. Again both possibilities were found. Using phage display enriched sequences could not be found as a linear substring of the knob aminoacid sequence. Using the x-ray structure of knob, different locations for the antibody epitopes were proposed. These could be confirmed by meanwhile available data from the co-crystallisation of knob and CAR. In summary, epitopes for the analysed antibodies were proposed and verified by different methods. Only a combination of several methods appeared to be successful. To better characterize conformational epitopes the peptide scan method was established and optimized. The strong points of phage display for the search for unknown bindingpartners were evaluated and a new priming strategy for random primed cDNA libraries was developed. abstract_translated_lang: eng date: 2002 date_type: published id_scheme: DOI id_number: 10.11588/heidok.00002018 ppn_swb: 1643280104 own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-opus-20188 date_accepted: 2002-02-26 advisor: HASH(0x55fc323e94a0) language: ger bibsort: BRAUNINGRUANALYSEVON2002 full_text_status: public citation: Bräuning, Rüdiger (2002) Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen mittels Phage-Display. [Dissertation] document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/2018/1/Dissertation_Braeuning_print.pdf