%0 Generic
%A Weidemann, Thomas
%D 2002
%F heidok:2217
%K Fluoreszenzmarkierung , Rezeptor-Liganden-Bindung , Zwei-Farben-FCS , intrazelluläre DiffusionChromatin , Histones , Cell Nucleus , Fluorescence Correlation Spectroscopy , Confocal Laser Scanning Microscopy
%R 10.11588/heidok.00002217
%T Quantitative Untersuchung der Verteilung, Mobilität und Bindung von fluoreszenzmarkierten Histonen in vitro und in vivo mit Fluoreszenzfluktuationsmikroskopie
%U https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/2217/
%X Der Bindungszustand von Histonen an DNA in vitro und in vivo sowie ihre Verteilung und Mobilität in der Zelle werden mit Hilfe von Fluoreszenz untersucht. Dazu werden Histonproteine sowohl synthetisch mit organischen Farbstoffen konjugiert als auch die Fusionsproteine von H2B und H1 mit EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) in HeLa-Zellen exprimiert. Die Messungen erfolgen mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und kontinuierlichem Bleichen der Fluoreszenz (CP) im gleichen optischen Aufbau, dem Fluoreszenzfluktuationsmikroskop (FFM). Ein theoretischer Formalismus für FCS wird auf zwei Anwendungsbereiche erweitert: Erstens die allgemeine Analyse bimolekularer Bindungsreaktionen über Zwei-Farben-FCS und zweitens die Bestimmung von Anzahl und Fluoreszenzausbeute der gebundenen Farbstoffe mit Ein-Farben-FCS. Die Theorie wird im Experiment an isolierten, markierten Nukleosomenketten angewendet. Bei sehr niedriger Ionenstärke kann zwischen den Nukleosomen ein geringfügiger Austausch der Histone nachgewiesen werden. In lebenden Zellen wird die Verteilung und Mobilität einer H2B-EYFP-exprimierenden Zellinie untersucht. Es wird ein Ansatz aufgezeigt, wie über FCS-Messungen im Cytoplasma die im konfokalen Bild aufgezeichneten Intensitäten in absolute Konzentrationen von Fluorophoren umgerechnet werden können. Über Bleichmessungen wird ein Reservoir von frei diffundierendem H2B-EYFP von den in der Chromatinfiber immobilisierten Komponenten diskriminiert. Über eine in vitro bestimmte Einbaurate der Fusionsproteine in die Nukleosomen können aus den konfokalen Bildern Nukleosomendichtekarten für HeLa-Zellkerne erstellt werden. Eine statistische Auswertung der Konzentrationen erfolgt mit Histogrammen und ergibt mittlere Nukleosomendichten in der Interphase zwischen 110 und 140 µM, während in mitotischen Chromosomen Maximalwerte bis zu 450 µM gemessen werden. 
%Z Teile in: Analysis of Ligand Binding by Two-Colour Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy, Single Mol. 3(1), p. 49-61 (2002)