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type: doctoralThesis
metadata_visibility: show
creators_name: Scholl, Stefan
title: pH in the trans-Golgi network/early endosome of Arabidopsis thaliana: Suppliers and consumers
subjects: 570
divisions: 140001
adv_faculty: af-14
abstract: The trans-Golgi network (TGN)/ early endosome (EE) is the main sorting station for proteins
travelling along the secretory- or endocytic route. Acidification by the TGN/EE-localised
vacuolar-type proton (H+)-ATPase (V-ATPase) is essential for functional protein trafficking as
well as compartment structure. Inhibition of this V-ATPase ceases protein trafficking through the
TGN/EE and inhibits cell elongation. To sustain TGN/EE functions, luminal pH has to be kept on
a homeostatic level. A mechanism to maintain V-ATPase-mediated acidification is to balance the
bulk positive charges in the TGN/EE lumen accumulated by H+ pumping via parallel anion
import. However, previous measurements of V-ATPase-dependent acidification in the TGN/EE
were mainly done in transient expression systems and used sensors suited for rather alkaline pH
conditions. Furthermore, TGN/EE-localised anion transporter from the ClC-family which have
been proposed to serve in luminal charge balance are largely uncharacterised. For that purpose,
in vivo TGN/EE pH measurements using the genetically encoded pH sensor pHusion linked to
the TGN/EE resident protein SYP61 were established. We determined that the steady state pH
of 5,6 in the TGN/EE in Arabidopsis roots is controlled by the combined activity of the V-ATPase
and H+-coupled antiporters. Moreover the role of ClCd and ClCf in supporting the TGN/EElocalised
V-ATPase in acidification was investigated. Whereas knock-out of both TGN/EElocalised
ClCs caused male gametophyte lethality, we identified via inducible knock-downs an
essential role of both transporters in cell elongation. However, neither TGN/EE pH nor TGN/EEmediated
trafficking was altered upon reduced reduction of ClCf in the clcd background.
Curiously, trans-Golgi pH was more acidic than WT due to a partial mislocalisation of the
TGN/EE-localised V-ATPases to the Golgi stack. Finally, a computational modelling approach
suggested that ClCd functions as Cl-/H+ antiporter whereas clear predictions on ClCf functions
could not been made. We established a method to measure V-ATPase-mediated TGN/EE
acidification in vivo in Arabidopsis thaliana. Furthermore, we showed that the TGN/EE is
acidified by the V-ATPase and co-determined by TGN/EE-localised transporters. Besides VATPase
activity, anion import in the TGN/EE mediated by two ClC members ClCd and ClCf is
essential for cell elongation. By that we revealed a previously unknown role of luminal anion
homeostasis in the TGN/EE.
abstract_translated_text: Das "trans-Golgi network (TGN)/ early endosome (EE)" ist das zentrale Verteiler-Kompartiment
für Proteine, die über den sekretorischen und endozytischen Weg transportiert werden. Alle
Transportfunktionen des TGN/EEs sowie dessen Struktur, sind abhängig von der Aktivität einer
V-Typ H+-ATPase (V-ATPase). Inhibierung dieser Protonenpumpe blockiert alle
Proteintransportwege durch das TGN/EE und hemmt, als eine direkte Folge, die Zellelongation.
Um eine korrekte Funktion des TGN/EEs zu gewährleisten ist es notwendig, dass der luminale
pH Wert des TGN/EEs konstant gehalten wird. Ein Mechanismus hierfür ist ein
Ladungsausgleich der positiven H+ Ionen, die durch die V-ATPase zur luminalen Ansäuerung
importiert werden, durch parallelen Anionen-Einstrom. Bisherige Messungen der V-ATPaseabhängigen
Ansäuerung des TGN/EE Lumens wurden hauptsächlich in transienten
Expressionssystemen durchgeführt, unter der Verwendung von pH Sensoren die in alkalischen
Bedingungen funktional sind. Darüber hinaus wurden Anionen Transporter aus der ClC-Familie,
die als Kandidaten zum Import von Gegenionen vorgeschlagen wurden, bisher nur marginal
charakterisiert. Aus diesem Grund wurde in einem Teil dieser Arbeit eine Methode etabliert, um
den pH Wert des TGN/EE von Arabidopsis thaliana, in vivo zu messen. Für die spezifische
Messung im TGN/EE wurde der genetisch-kodierte pH Sensor pHusion mit dem TGN/EE
lokalisierten Protein SYP61 gekoppelt. Mit dieser Methode konnte in Wurzeln von Arabidopsis
thaliana ein pH Wert von 5,6 im TGN/EE gemessen werden, der zum Einen von der V-ATPase
und zum Anderen von H+ gekoppelten K+ Antiporter der NHX-Klasse bestimmt wird.
Desweiteren wurden zwei TGN/EE lokalisierte, potenzielle Anionen/H+ - Transporter aus der
ClC-Familie, ClCd und ClCf, untersucht und deren Rolle im Ladungsausgleich des TGN/EE
Lumen charakterisiert. Ein gentischer knock-out von ClCd und ClCf ist letal für den männlichen
Gametophyten sodass durch eine induzierbare, artifizielle micro RNA gegen ClCf im clcd
Hintergrund gezeigt werden konnte, dass ClCd und ClCf eine essentielle Rolle in der
Zellelongation besitzen. Eine Veränderung des TGN/EE pH konnte hingegen nicht festgestellt
werden und der intrazellulärer Transport ausgehend vom TGN/EE war in induzierten knockdowns
von ClCf in clcd ebenfalls nicht beeinträchtigt. Interessanterweise wurde eine
Ansäuerung der trans-Golgi Zisterne gemessen, die durch teilweise Misslokalisation der
TGN/EE-lokaliseren V-ATPase zur trans-Golgi Seite bedingt wurde. Schließlich wurde über
computerbasiertes Modelling eine Funktion von ClCd als Cl-/H+ Antiporter vorgeschlagen. Die
Funktion von ClCf und das durch ClCf transportierte Anion konnte nicht zweifelsfrei bestimmt
werden. Durch in vivo TGN/EE pH Messungen wurde gezeigt, dass der TGN/EE pH durch die VATPase generiert und durch TGN/EE-lokalisierte Transporter beeinflusst wird. Desweiteren ist
neben Protonenimport durch die V-ATPase, Anionenimport in das TGN/EE durch die zwei ClC
Transporter ClCd und ClCf essentiell für die Zellelongation, womit eine bisher unbekannte,
physiologische Rolle von Anionen/Chlorid im TGN/EE identifiziert wurde.
abstract_translated_lang: ger
date: 2018
id_scheme: DOI
id_number: 10.11588/heidok.00023248
ppn_swb: 1655667602
own_urn: urn:nbn:de:bsz:16-heidok-232487
date_accepted: 2017-07-14
advisor: HASH(0x564e1c58d098)
language: eng
bibsort: SCHOLLSTEFPHINTHETRA2018
full_text_status: public
citation:   Scholl, Stefan  (2018) pH in the trans-Golgi network/early endosome of Arabidopsis thaliana: Suppliers and consumers.  [Dissertation]     
document_url: https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/23248/1/Dissertation%20Stefan%20Scholl%202017.pdf