TY  - GEN
N2  - Rationale: Bluthochdruck-assoziierte Herz- und Kreislauferkrankungen bilden weltweit die häufigste Todesursache. Besonders vaskulären, pathophysiologischen Zuständen geht oft ein arterieller Gefäßwandumbau voraus. Maßgeblich an diesem Umbau beteiligt sind glatte Gefäßmuskelzellen (GMZ). Diese erhalten im arteriellen System durch Kontraktion den myogenen Tonus aufrecht. Verändert sich das arterielle System pathologisch, beginnen GMZ zu proliferieren, zu migrieren und Matrixbestandteile freizusetzen. Die Fähigkeit dieser Zellen, ihre Funktion an die umgebende Situation anzupassen, wird Phänotypwechsel genannt. Sobald eine Zelle beginnt sich zu teilen oder zu migrieren, hat sie den synthetischen Phänotyp angenommen. Die Expression von Genprodukten des kontraktilen Apparates (z.B. smooth muscle-myosin heavy chain (SM-MHC) und Calponin) markiert dagegen ihren kontraktilen Phänotyp. Diese biologische Plastizität wird durch aktivierte G-Protein-Rezeptoren mitbestimmt, die gekoppelt sind an unterschiedliche G?-Untereinheiten wie G?s, G?12/13, G?q/11 und G?i/o. Die beschleunigte Terminierung aktiver G?-Untereinheiten erfolgt durch regulators of g-protein signaling (RGS) Proteine. RGS5 kann in GMZ in der Funktion als GTPase-activating protein (GAP) die Terminierung der Aktivität der Untereinheiten G?q/11 und G?i/o beschleunigen. Im arteriellen System kommt RGS5 eine besondere Bedeutung zu. Über die Involvierung von RGS5 in unterschiedliche pathologische Zusammenhänge wie Arteriogenese, Bluthochdruck und Neointimabildung wurde bereits berichtet. Die grundlegende Wirkung von RGS5 auf den Phänotypwechsel von GMZ, unabhängig von Umbauprozessen, wurde allerdings noch nicht untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst der grundlegende Einfluss von RGS5 auf den Phänotyp kultivierter, synthetisch aktiver GMZ untersucht werden. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob der G?q/11- und/oder G?i/o-abhängige Signalweg die beobachteten Veränderungen bedingen könnte. In einem weiteren Ansatz sollten kultivierte GMZ biomechanisch gedehnt werden, um zu untersuchen, ob RGS5 einen Einfluss auf die Dehnungsantwort dieser Zellen hat. Zudem sollte eine transgene Maus generiert werden, die RGS5 ausschließlich in GMZ überexprimiert, um in einem späteren Ansatz die Relevanz der in vitro-Ergebnisse durch in vivo-Versuche zu überprüfen.
Methoden und Ergebnisse: (I) Anhand einer Transkriptomanalyse konnte unter Adenovirus-Vektor-induzierter RGS5-Überexpression die reduzierte Expression zellzyklusabhängiger Gene erfasst werden. Eine reduzierte Anzahl sich teilender Zellkerne nach RGS5-Überexpression bestätigte eine Einschränkung der Zellteilung. Neben der Proliferation ist auch die Migration ein Merkmal des Phänotypwechsels. Im Rahmen von Migrationsuntersuchungen konnte dazu eine Hemmung der Migration der GMZ nach RGS5-Überexpression beobachtet werden. Ferner konnte nach RGS5-Überexpression ein Calponin-Anstieg in kultivierten GMZ dokumentiert werden. Um die Spezifität RGS5-vermittelter Effekte auf den Phänotyp kultivierter GMZ beurteilen zu können, wurde RGS16, das im Vergleich zu RGS5 eine schwächere Inhibition der G?i/o-Aktivität bewirkt, ebenfalls überexprimiert und bezüglich seiner Wirkung untersucht. Eine Überexpression von RGS16 zeigte dabei lediglich in Proliferationsuntersuchungen einen signifikanten RGS5-ähnlichen Effekt. Die Erfassung von möglichen, ebenfalls an den beobachteten Effekten beteiligten Signalmolekülen erfolgte zunächst mit Hilfe eines Proteinkinasenaktivitäts-Arrays. Dabei zeigte sich nach RGS5-Überexpression eine reduzierte Phosphorylierung der MAP-Kinase ERK1/2. Im Rahmen dieser Arbeit ahmte ausschließlich die Inhibition der Aktivität der G?i/o-Untereinheit und damit die Aktivierung der Adenylatzyklase durch deren Stimulator Forskolin die Effekte von RGS5 auf die Phosphorylierung von ERK1/2, die Proliferation und Migration nach.
(II und III) Nach RGS5-Überexpression konnte in GMZ ein Anstieg der RhoA-Aktivität beobachtet werden. RhoA ist wiederum bei der Dehnungsantwort und damit u.a. an dem Phänotypwechsel dieser Zellen beteiligt. In gedehnten GMZ wurde gleichzeitig ein Anstieg der RGS5-Menge beobachtet. Um nun zu überprüfen, ob das erhöhte RGS5-Vorkommen die Dehnungsantwort dieser Zellen beeinflusst, wurde eine weitere Transkriptomanalyse durchgeführt. Nach biomechanischer Dehnung der GMZ, die RGS5 überexprimieren, konnte dabei ein Anstieg in der Expression der Gene mki67 und cdk1, deren Genprodukte die Zellteilung anzeigen, festgestellt werden. Gleichzeitig stieg die Genexpression typischer dehnungsassoziierter Marker wie Interleukin-8 und Interleukin-33 an.
(IV) Die Generierung einer transgenen Maus sollte es ermöglichen eine RGS5-Überexpression ausschließlich in GMZ einzuleiten. Damit sollte die Relevanz der in vitro-Effekte von RGS5 in vivo untersucht werden. Initiale Versuche zeigten eine erfolgreiche Induktion der mRNA-Expression von RGS5 in Gefäßen und GMZ nach Tamoxifen-Induktion der Cre-Rekombinase-Expression bzw. Cre Rekombinase-Behandlung.
Zusammenfassung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen im in vitro-Kontext (I) eine Redifferenzierung des in vitro bereits synthetisch aktiven Phänotyps von GMZ zum kontraktilen Phänotyp durch RGS5-Überexpression. Zusätzlich weisen die Daten für RGS5 (II) auf eine mögliche Rolle als Dehnungssensibilisator in GMZ hin. Des Weiteren lassen diese Befunde (III) eine kontext-gebundene Wirkweise für RGS5 in GMZ vermuten. Mit der Generierung der transgenen Maus (IV), die RGS5 glattmuskelzellspezifisch und induzierbar verstärkt exprimiert, konnte der Grundstein gelegt werden für in vivo-Untersuchungen der RGS5-Funktion im pathophysiologischen Kontext.
UR  - https://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/24760/
TI  - Der Einfluss von RGS5 auf den Phänotyp von arteriellen glatten Gefäßmuskelzellen
Y1  - 2018///
AV  - public
A1  - Demirel, Eda
ID  - heidok24760
ER  -